內蒙古四個毒絲蓋傘形態(tài)學及rDNA-ITS鑒定

田慧敏 尹 元

（赤峰學院生命科學學院，內蒙古赤峰024000）

絲蓋傘屬（Inocybe）隸屬擔子菌門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales）[1]。該屬的形態(tài)特征主要為子實體較小，多為斗笠狀菌蓋，深肉桂色至銹色，有鱗片，伸展后菌蓋中間部分凸起，邊緣部分易開裂。菌肉白色。菌褶直生至近延生，淡銹色，褶緣白色。菌柄多為圓柱形，近白色，內部實心，表面有褐色鱗片。孢子淡銹色，表面光滑，近橢圓形。囊狀體有或無，有的頂端有結晶。菌蓋及菌柄表皮多為整齊排列的菌絲[2]。該屬的成員都為外生菌根菌，與闊葉林和針葉林形成外生菌根，特別是山毛櫸、樺木、楊樹等形成外生菌根，促進樹木的發(fā)育，不僅提高木材的產量和質量，具有經(jīng)濟效益，而且具有較高的環(huán)境效益，在生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用。由于絲蓋傘屬種類、外形因環(huán)境不同變化大、種內變異豐富、分類鑒定難度較大，導致資源利用、中毒救治等方面受限，因此傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類鑒定有一定的局限性和主觀性。20世紀90年代開始國內外菌物學家在大型真菌分子鑒定的方法上做了許多嘗試和探討，ITS以其快速、準確、簡便等優(yōu)點在大型真菌鑒定中得到了迅速的發(fā)展和廣泛應用，ITS已大量用于對絲蓋傘屬的鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及親緣關系分析中[3-8]。筆者采用形態(tài)學和ITS片段測序技術相結合的鑒定方法對赤峰市不同地區(qū)五個絲蓋傘屬的真菌進行鑒定，力求探索絲蓋傘屬真菌的準確鑒定方法，為真菌的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試4個標本均由筆者于2016、2017年采集于赤峰市不同地區(qū)，CFSZ11663（赤峰市松山區(qū)神仙溝風景區(qū)楊樹林地，東經(jīng) 118°18′～118°19′，北緯42°06′30″～42°08′30″）、CFSZ13074（赤峰市松山區(qū)城子鄉(xiāng)盔甲山風景區(qū)油松林地）、CFSZ10362（赤峰市巴林右旗賽罕烏拉國家級自然保護區(qū)樟子松林地，東經(jīng)118°18′～118°55′，北緯43°59′～44°27′）、CFSZ11344（赤峰市翁牛特旗五分地鎮(zhèn)巴林橋楊樹林地。采集的標本在拍攝生境照片、觀察形態(tài)、測量數(shù)據(jù)、自然干燥、編寫號碼、超低溫冷凍等系列處理之后存放于赤峰學院生科院菌物標本室（CFSZ）。

1.2 形態(tài)鑒定

采用宏觀特征和顯微結構的鑒定方法，宏觀特征采用肉眼觀察、游標卡尺測量等方法，需要測量供試樣本的新鮮子實體大小、顏色、菌柄長度以及直徑、菌蓋直徑。查閱大量文獻進行檢索、比對、定種；顯微結構在光學顯微鏡（奧特BED203）下觀察和測量孢子、擔子、囊狀體、鎖狀聯(lián)合、菌蓋表皮、菌柄表皮菌絲形態(tài)及大小等，所有數(shù)據(jù)均測量20個，用顯微照相系統(tǒng)（Olympus BX53）拍攝顯微結構相片。

1.3 ITS鑒定

1.3.1 DNA的提取

取干樣品子實體菌蓋的一小部分研磨，稱量30 mg使用基因組DNA提取試劑盒完成對基因組DNA的提取。

圖1 華美絲蓋傘子實體形態(tài)及微觀結構

1.3.2 PCR擴增、純化及測序

PCR擴增反應在PCR擴增儀（eppendorf 5331）上進行。

經(jīng)引物ITS1/ITS4進行50μL體系PCR擴增后，在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。樣品PCR擴增之后的產物用Takara膠純化試劑盒純化后，交由生物科技公司完成測序[9]。

1.3.3 ITS序列比對分析

將得到的ITS序列，通過Chromas軟件拼接，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行ITS序列的Blast比對，從檢索的結果里挑選出同源性比較高的ITS序列，利用MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹的每個分支統(tǒng)計學顯著性分析以最大似然法進行檢驗，重復次數(shù)為1000次。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定結果

經(jīng)形態(tài)學鑒定，CFSZ11663為華美絲蓋傘Inocybe splendensR.Heim，CFSZ13074為污白絲蓋傘Inocybe geophylla（Bull.）P.Kumm.，CFSZ10362 為 斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.，CFSZ11344為茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.。

2.1.1 華美絲蓋傘Inocybe splendensR.Heim（內蒙古新記錄種）

子實體偏小;菌蓋直徑1.7～2.0 cm，斗笠狀，深棕色，中間部分顏色較深，表面具呈放射狀縱條紋的纖毛；菌褶彎生，淺灰棕色；菌柄長3.0～4.4 cm，粗0.2～0.7 cm，乳白色至淺棕色（圖1，a、b）。

孢子（9.5～12.0）μm×（5.0～9.0）μm，紡錘形，表面光滑，無色（圖1，c）；擔子（30.5～34.0）μm×（11.0～12.5）μm（圖 1，d）；側生囊狀體（55.0～98.0）μm×（24～33.5）μm，腹鼓狀，囊狀體頂端有結晶（圖1，e）；菌蓋表皮部分菌絲無色，有隔膜，具分支，直徑13.0～19.0 μm，蓋面囊狀體直徑28.5～33.5 μm（圖1，f、g）；菌柄表皮部分菌絲無色，有隔膜，直徑測量得7.0～9.0μm，具鎖狀聯(lián)合（圖1，h）。

該種主要特點為菌蓋棕色，具黃褐色放射狀纖毛，褶側囊體很大，長達98μm，菌蓋表皮菌絲膨大呈腹鼓狀寬達34μm。屬華美組SectionSplendentes鱗毛亞組 supersection“Marginatae”[10]，該種分布于吉林，其他地區(qū)未見報道，為內蒙古新記錄種[11]。

2.1.2 污白絲蓋傘紫色變種Inocybe geophyllavar.lilacina（Peck）Gille

子實體偏小，菌蓋直徑1.2～1.8 cm，斗笠形，污白色具紫色光澤，中部呈現(xiàn)黃色，邊緣為齒狀；菌肉白色；菌褶銹色，直生或彎生，著生較密，菌褶不等長；菌柄長3.7 cm，粗0.2 cm，灰白色，較為光滑（圖2，a、b）。

孢子（7.0～11.5）μm×（4.0～7.0）μm，近橢圓形，表面光滑，淡銹色，有內含物（圖2，c）；擔子（26.0～34.0）μm×（9.5～12.0）μm，無色，棒狀，具四個小梗（圖 2，d）；囊狀體大小為（50.0～62.5）μm×（12.0～23.0）μm，囊狀體壁厚，頂端有結晶（圖2，e）；菌蓋表皮部分菌絲無色，整齊排列，具隔膜，有分支，具鎖狀聯(lián)合，直徑7.0～10.0 μm（圖2，f、g）；菌柄表皮部分菌絲整齊排列，無隔膜，有鎖狀聯(lián)合，直徑6.5～8.5 μm（圖2，h）。

該種為污白絲蓋傘Inocybe geophylla的變種。主要特點是菌蓋呈淡紫色，菌蓋表皮菌絲不膨大，鎖狀聯(lián)合多，其他特征均一致。該種于1972年被描述定種為Inocybe geophyllavar.lilacina[12]，在我國廣泛分布。

圖2 污白絲蓋傘紫色變種子實體形態(tài)及微觀結構

圖3 斑紋絲蓋傘子實體形態(tài)及微觀結構

2.1.3 斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.

子實體較大，菌蓋直徑7～8 cm，斗笠形，黃色，有條紋，干后變銹色，邊緣有殘留的菌幕；菌褶淺灰棕色，等長，干后變?yōu)殇P色，遇KOH變黑銹色；菌肉白色；菌柄長度為9 cm，粗約0.8～1 cm，淡黃色，中生（圖3，a、b）。

孢子（7.5～9.5）μm×（5.5～7.0）μm，橢圓形，表面光滑，無色，非淀粉質（圖 3，c）；擔子（21.6～31.2）μm×（7.2～10.1）μm，無色，棒狀，具四個小梗（圖3，d）；沒有囊狀體；菌蓋表皮部分菌絲無色，隔膜均勻，具鎖狀聯(lián)合，直徑6～6.8μm，有膨大菌絲，直徑14.4～31.2 μm（圖3，e）；菌柄表皮部分菌絲整齊排列，無色，有隔膜，直徑6.8～16.4μm。

該種主要特點是菌蓋邊緣具有白色菌幕殘留，褶側囊體無[13-14]，屬于Inosperma亞屬裂蓋組Rimosae組[15]。

2.1.4 茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.

子實體中等大小，菌蓋直徑約4.2 cm，斗笠形，中間部分凸起，頂部茶褐色，邊緣色淺，有棕色片狀鱗片；菌肉白色；菌褶棕色至銹色，不等長，較疏，著生方式為彎生；菌柄長度為10.2 cm，粗約0.4 cm，土黃色，基部膨大（圖4，a、b）。

孢子（9.6～12）μm×（5.3～7.2）μm，橢圓形，表面光滑，銹色，有內含物，非淀粉質（圖 4，c）；擔子（23.6～34.1）μm×（9.1～11.8）μm，無色，棒狀，具四個小梗（圖4，d）；褶側囊體和褶緣囊體均無，菌蓋表皮部分的菌絲無色，存在膨大細胞（74.4～108）μm×（24～48）μm，其余菌絲整齊排列，具均勻隔膜，直徑7.7～12.3μm（圖4，e）；菌柄表皮部分的菌絲整齊排列，無色，有隔膜，直徑8.4～14.9μm。

圖4 茶褐絲蓋傘子實體形態(tài)及微觀結構

圖5 供試樣品和Genbank的最相似物種的ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹

該種主要特點是菌蓋具有褐色片狀小鱗片，無囊狀體，菌蓋表皮膨大，最寬可達48μm[16]。在我國分布廣泛。

2.2 rDNA-ITS測序鑒定結果

2.2.1 四個絲蓋傘屬真菌樣品的ITS測序結果

PCR擴增的4個樣品DNA的ITS序列，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可得出CFSZ11663約為680 bp，登錄號為MG367267；CFSZ13074 約為710 bp，登錄號為 MG367268；CFSZ10362 約為600 bp，登錄號為MG367269；CFSZ10460 約為680 bp，登錄號為MG367270；CFSZ11344 約為700 bp，登錄號為MG367272。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果

對 4個樣本11663、13074、10362、11344的 ITS序列及與其高度相似的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

結果表明：與5個供試標本相似的20個來自Genbank最相似的序列均為絲蓋傘屬（Inocybe）。其中11663與Inocybe splendens聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本11663鑒定為華美絲蓋傘（Inocybe splendensR.Heim）。13074與Inocybe geophylla聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本13074鑒定為污白絲蓋傘紫色變種[Inocybe geophyllavar.lilacina（Peck）Gille]。10362 與Inocybe maculata聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本CFSZ10362鑒定為斑紋絲蓋傘（Inocybe maculataBoud.）。11344與Inocybe umbrinella聚在一起，結合宏觀特征和微觀結構將標本11344鑒定為茶褐絲蓋傘（Inocybe umbrinellaBres.）（圖5）。

3 小 結

研究將分子鑒定與形態(tài)鑒定相結合，二者的鑒定結果基本吻合，11663鑒定為華美絲蓋傘Inocybe splendensR.Heim，13074鑒定為污白絲蓋傘紫色變種Inocybe geophyllavarlilacina（Peck）Gille，10362鑒定為斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.，11344鑒定為茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.。其中Inocybe obsoletaRomagn為中國新記錄種，污白絲蓋傘紫色變種Inocybe geophylla，斑紋絲蓋傘Inocybe maculataBoud.，茶褐絲蓋傘Inocybe umbrinellaBres.為有毒菌類，誤食后會產生神經(jīng)精神型癥狀。研究為菌物資源的鑒定及安全開發(fā)提供依據(jù)，為有毒菌類的準確鑒定提供了方法。rDNA-ITS序列分析的應用隨著分子生物技術的快速發(fā)展，會有更廣闊的發(fā)展前景，為真菌的研究提供更加快速、準確的鑒定方法。