葉酸受體α高表達(dá)與漿液性卵巢癌患者生存率的相關(guān)性研究

符吉芬，裴雄越，王愛麗

（海南省海口市中醫(yī)院 婦產(chǎn)科，海南 ?？?570102）

卵巢癌是致死率高的婦科惡性腫瘤，其無明顯病理特征、早期診斷困難及缺乏精確腫瘤標(biāo)記等都是造成卵巢癌預(yù)后非常差的原因[1]。其中漿液性卵巢癌占卵巢癌的50%，因此尋找新生物標(biāo)志物對于卵巢癌治療方案評估與預(yù)后非常重要。

腫瘤抗原125（carcinoma antigen 125, CA125）是最常用于監(jiān)控卵巢癌患者對治療反應(yīng)的一種生物指標(biāo)[2]。但CA125的升高也可見于一些良性的狀況（如子宮內(nèi)膜異例、子宮肌瘤或盆腔炎等[3-4]。葉酸參與細(xì)胞內(nèi)代謝與DNA合成、修復(fù)，是正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的必需維生素。葉酸受體α（alpha-folate receptor，F(xiàn)R-α）分子量為38～40 kD的細(xì)胞膜蛋白，容易與氧化葉酸結(jié)合，在正常細(xì)胞中不表達(dá)，大量表達(dá)于各種非黏液性（non-mucinous）上皮組織腫瘤細(xì)胞中（如卵巢癌）。但是FR-α在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)機制仍不清楚，一般認(rèn)為是腫瘤在發(fā)展過程中用來調(diào)控從血清中攝取的葉酸量，或參與信號調(diào)控作用[5-7]。本研究主要分析FR-α在漿液性卵巢癌中表達(dá)的臨床意義，探討其作為漿液性卵巢癌生物標(biāo)志物和治療靶點的潛能。

1 資料與方法

1.1 一般研究

選取2005年1月—2010年12月?？谑兄嗅t(yī)院接受分期手術(shù)與減積手術(shù)的91例漿液性卵巢癌患者，除Ia期及高分化患者，其他患者接受分期手術(shù)或減積手術(shù)后，接受4～6次以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療?；颊吣挲g、絕經(jīng)狀態(tài)、術(shù)前CA125含量、治療史、減積手術(shù)時疾病狀態(tài)及復(fù)發(fā)與生存率等臨床參數(shù)均來自患者醫(yī)療、外科及出院記錄。術(shù)后殘留腫瘤最大直徑≤1 cm時，便將此次減積手術(shù)定義為理想減積手術(shù)，否則歸類為次理想減積手術(shù)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查通過，患者簽署知情同意書。

1.2 隨訪

術(shù)后前2年，患者每隔3個月來院復(fù)查1次。復(fù)查項目包括病史詢問、骨盆與直腸檢查和局部淋巴結(jié)觸診；2年后每半年復(fù)查1次。每次復(fù)查檢測患者血清CA125含量與宮頸涂片檢查。一旦懷疑復(fù)發(fā)，則進(jìn)行CT與MRI檢查。影像檢查顯示異常征象、腹水細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果異常及2周1次腫瘤指標(biāo)檢查結(jié)果連續(xù)2次≥正常最高值的2倍或是組織切片發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，則認(rèn)為疾病復(fù)發(fā)。

1.3 卵巢癌腫瘤組織FR-α表達(dá)的檢測

標(biāo)本離體后30 min內(nèi)取材，迅速置于液氮中冷凍于-80℃冰箱冷凍保存。提取總RNA，鑒定其濃度、純度及完整性。FR-α引物序列：正向5'-ACCCAG AAGACTGTGGATGG-3'，反向 5'-TGCTGTAGCCAAAT TCGTTG-3'。探針序列：FAM5'-ACTGCTGTCATGCC GTGCCCCTCT-3'TAMR（FAM和TAMR為探針兩端發(fā)光基團(tuán)）。GAPDH引物序列：正向5'-CCGGACTAGA CTGAGCCAGACGGAGAGC-3'，反向5'-CCGGAATTC GCAGGGATTTCCAGGTATCA-3'；探針序列：FAM5'-ACTGCTGTCATGCCGTGCCCCTCT-3'TAMR。反應(yīng)條件：50℃復(fù)溫2 min，95℃預(yù)變性10 min，循環(huán)1次；95℃變性15 s，60℃退火1 min，95℃延伸15 s，循環(huán)40次；60℃終末延伸1 min，循環(huán)1次。反應(yīng)結(jié)束后用ABI prism 7000 SDS Software進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合并計算各目的基因拷貝數(shù)，F(xiàn)R-α基因相對表達(dá)量為FR-α基因拷貝數(shù)與內(nèi)參GAPDH基因拷貝數(shù)的比值。

1.4 CA125檢測

清晨空腹取血5 ml，分離血清，采用流式熒光發(fā)光法檢測癌胚抗原，儀器為上海透景生命科技有限公司生產(chǎn)的流式熒光發(fā)光儀TELLGEN，使用廠家配套試劑。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，卵巢癌患者臨床特征與術(shù)前血清CA125含量、FR-α表達(dá)量關(guān)系用Kruskal-WallisH檢驗及Mann-WhitneyU檢驗，組間比較用χ2檢驗；Kaplan-Meier生存曲線分析患者生存率，并進(jìn)行Log-rank檢驗；采用Cox回歸單因素和多因素分析無病生存率（free disease survival, FDS）和總生存率（overall survival, OS）的影響因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漿液性卵巢癌患者臨床特征與術(shù)前血清CA125含量、FR-α表達(dá)量的相關(guān)性

91例漿液性卵巢癌患者隨訪中位時間為19個月（5～78）個月，確診時患者年齡中位數(shù)為55歲（41～66歲）。91例患者中包括4例FIGO I期、6例FIGO Ⅱ期、65例FIGO Ⅲ期、16例FIGO Ⅳ期，其中40例患者（44%）術(shù)后殘余腫瘤直徑≤1 cm，術(shù)前血清中CA125含量中位值1 402 u/ml，卵巢癌組織中FR-α表達(dá)量為0.652。

晚期和接受次理想減積手術(shù)患者卵巢癌組織FR-α表達(dá)量高于早期或是接受理想減積手術(shù)患者。術(shù)前晚期卵巢癌患者CA125血清含量高于早期患者（P＜0.05），但接受理想減積手術(shù)和次理想減積手術(shù)患者與早、晚期手術(shù)患者血清CA125含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2 影響FDS的Cox逐步回歸分析

單因素分析顯示，F(xiàn)IGO分期、腫瘤分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并不影響到患者FDS。即使將患者以術(shù)前CA125含量1 000 u/ml為閾值分為兩組，CA125也與FDS無關(guān)。但是單因素分析顯示，患者不能接受理想減積手術(shù)、患者接受治療后63 d血清中CA125含量不能降至正常值以下（＜35 u/ml）、卵巢癌織FR-α高表達(dá)3個因素與患者較FDS相關(guān)。多因素分析發(fā)現(xiàn)，血清中CA125在患者接受治療63 d后無法降至正常值以下與卵巢癌組織FR-α高表達(dá)是FDS的危險預(yù)后因子（P＜0.05）。見表 2、3。

2.3 影響OS的預(yù)后因子分析

單因素分析表明FIGO分期、腫瘤分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否對OS無影響。術(shù)前CA125含量≥1 000 u/ml對OS也無影響。然而未接受理想減積手術(shù)、患者血清CA125接受治療后63 d未降至正常值以下、FR-α高表達(dá)與OS相關(guān)。多因素分析顯示，患者血清中CA125接受治療后63 d未降至正常值以下和FR-α高表達(dá)是OS的危險預(yù)后因子。見表4、5。

將患者分為FR-α高表達(dá)組（FR-α/GADPH≥1.0）和FR-α低表達(dá)組（FR-α/GADPH＜1.0，比較兩組FDS和OS后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)R-α高表達(dá)時，F(xiàn)DS更短見附圖。2.073（1.051，4.084），P=0.043]和 OS 更差

表1 91例漿液性卵巢癌患者臨床特征與術(shù)前血清CA125含量、FR-α表達(dá)量關(guān)系分析 [M（P25，P75）]

表2 卵巢癌患者FDS影響因素的單因素分析

續(xù)表2

表3 卵巢癌患者FDS影響因素的多因素分析

表4 卵巢癌患者OS影響因素的單因素分析

續(xù)表4

表5 卵巢癌患者OS影響因素的多因素分析

附圖 FR-α表達(dá)與漿液性卵巢癌患者生存狀況的關(guān)系

3 討論

CA125是目前公認(rèn)的卵巢癌標(biāo)志物，也是卵巢癌術(shù)前評估的重要指標(biāo)。然而，CA125對早期漿液性卵巢癌的敏感度相當(dāng)?shù)蚚8]。除腫瘤分期，組織學(xué)類型、腫瘤分化程度及是否接受理想減積手術(shù)，都是能夠影響卵巢癌患者的預(yù)后因子[9]。與以往關(guān)于卵巢癌惡性度研究類似，本研究結(jié)果表明，術(shù)前患者CA125血清含量不能作為預(yù)估患者是否可以接受理想減積手術(shù)的標(biāo)志物。此外，本研究發(fā)現(xiàn)晚期卵巢癌患者卵巢癌組織FR-α高表達(dá)。TOFFOLI等研究也表明，晚期卵巢癌患者FR-α表達(dá)高于早期患者，提示FR-α在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[10]。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)R-α高表達(dá)與患者無法接受理想減積手術(shù)無關(guān)。P53及M2-PK等其他生物標(biāo)志物也與患者是否能接受理想減積手術(shù)相關(guān)。因此，聯(lián)合檢查該生物標(biāo)志物評估卵巢癌患者是否能接受理想減積手術(shù)是潛在的研究方向。

雖然FR-α在腫瘤細(xì)胞中的作用仍不清楚，F(xiàn)R-α在卵巢癌、腎臟癌及肝癌與乳癌等多種非黏液性惡性腫瘤中異常高表達(dá)。此外，F(xiàn)R-α也是腫瘤抗原之一，約70%左右的卵巢癌或者乳癌女性會對FR-α產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因為細(xì)胞膜蛋白酶與糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C、D結(jié)合，使表達(dá)于細(xì)胞表面的可溶解FR-α釋放。然而，MANTOVANI等研究表明，只有41%患者能在血清中檢測到FR-α。KALLI等則報道72%上皮卵巢癌患者（漿液性為81.7%，內(nèi)膜樣為66.7%，透明細(xì)胞型為63.3%，黏液癌為22.2%）中FR-α陽性反應(yīng)。但是目前尚無檢測α-FR表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此本研究采用管家基因GAPDH表達(dá)量作為基準(zhǔn)評估FR-α基因的表達(dá)量。

FR-α高表達(dá)與漿液性卵巢癌生存率呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示FR-α高表達(dá)患者FDS和OS較差。進(jìn)一步分析，以α-FR/GAPDH比值1.0為臨界值時，比值＜1的患者FDS和OS更短。KALLI等則研究表明，F(xiàn)R-α狀態(tài)與卵巢癌復(fù)發(fā)時間或者整體生存率無關(guān)。造成研究結(jié)果不一致的原因可能是，本研究將患者限定為漿液性卵巢癌患者，而KALLI等的研究中則包含其他各種組織學(xué)類型，如漿液性，黏液性與透明胞癌等。因此，未來仍需收集大樣本卵巢癌患者分析FR-α表達(dá)能否作為卵巢癌的預(yù)后因子。

研究表明，CA125降至正常值以下的時間與卵巢癌預(yù)后密切相關(guān)。本研究與以往研究均為發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清CA125含量與預(yù)后相關(guān)。但本研究與其他研究結(jié)果都顯示出血清CA125降至正常值以下的時間是卵巢癌患者治療響應(yīng)率和生存率的預(yù)后因子。本研究表明卵巢癌患者開始化療后，血清中CA125在63 d內(nèi)消退至正常范圍（＜35 u/ml），則患者FDS與OS更長。因此，血清中CA125下降越快提示卵巢癌細(xì)胞對化學(xué)藥物敏感度越高。

FR-α是卵巢癌治療的潛在生物標(biāo)志物，目前化療依舊是治療晚期卵巢癌的主要方法。卵巢癌易對化療藥物產(chǎn)生抗藥性，因此選擇個性化的化療方案對卵巢癌治療具有重要意義。由于FR-α具有組織特異性，可以在腫瘤治療過程中以FR-α為載體將細(xì)胞毒性藥物靶向運送至腫瘤細(xì)胞，從而避免對其他非腫瘤細(xì)胞和組織造成副作用。研究人員最近也使用與葉酸結(jié)合的治療藥物（如小分子化學(xué)藥物、負(fù)載藥物的脂質(zhì)體及反義寡核苷酸與免疫制劑等）都成功的將藥物運送至FR-α陽性反應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，以達(dá)腫瘤治療效果。由于FR-α在多種癌癥中均呈現(xiàn)高水平表達(dá)，且目前沒有標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一的檢測方法，且本研究屬于小樣本量研究，故仍需進(jìn)一步在大樣本中深入研究FR-α在卵巢中的價值。

綜上所述，F(xiàn)R-α高表達(dá)的漿液性卵巢癌患者FDS和OS較短。確認(rèn)FR-α表達(dá)能否作為卵巢癌存活率的生物預(yù)后標(biāo)志物，仍需要在大樣本量中研究證實。