靜脈或鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮對(duì)大鼠甲醛炎性痛的影響及機(jī)制探討*

彭志鋒，馬國(guó)英，楊靖輝

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，山西 大同 037009）

奈福泮是一種非阿片和甾體類鎮(zhèn)痛藥物。奈福泮鎮(zhèn)痛作用機(jī)制目前尚不明確，但以往研究提示，奈福泮可能通過(guò)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)再攝取，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[1]。最近的一項(xiàng)研究提示，奈福泮通過(guò)調(diào)節(jié)脊髓去甲腎上腺素水平在大鼠炎性痛模型中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[2]。此外，奈福泮鎮(zhèn)痛機(jī)制也可能涉及多巴胺的傳遞[3]。因?yàn)槎喟桶泛慕呖蓽p小奈福泮在大鼠熱板試驗(yàn)中的的鎮(zhèn)痛作用[4]。相反，多巴胺D2受體拮抗劑舒必利不影響奈福泮在小鼠扭體試驗(yàn)中的鎮(zhèn)痛作用，但可抑制奈福泮在甲醛試驗(yàn)的鎮(zhèn)痛作用[5]。目前奈福泮通過(guò)抑制多巴胺再攝取發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究目的是評(píng)估多巴胺能神經(jīng)傳遞在奈福泮鎮(zhèn)痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

45只雄性SD大鼠（225～250 g）購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。室內(nèi)溫度保持在22～23℃左右，濕度在50%左右。明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。按靜脈注射方式將大鼠分成對(duì)照組、鹽酸奈福泮組（1或3 mg/kg）及鹽酸奈福泮（3 mg/kg）+舒必利（3 mg/kg）組（奈福泮+舒必利組），對(duì)照組尾靜脈注射等量生理鹽水，每組5只大鼠。按鞘內(nèi)注射方式將大鼠分成對(duì)照組、鹽酸奈福泮組（3、10或30 μg）及鹽酸奈福泮（30 μg）+舒必利（100 μg）組，注射溶液均為10 μl，對(duì)照組鞘內(nèi)注射等量生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

鹽酸奈福泮（重慶西南藥業(yè)股份有限公司），舒必利（美國(guó)Sigma公司），甲醛（美國(guó)Sigma公司），立體定位儀（北京拜安吉科技有限公司），液相色譜儀器（南京科捷分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)制大鼠炎性痛模型 限制大鼠后，用注射器在各組大鼠后肢足底單次注射5%甲醛溶液50 μl。

1.3.2 大鼠鞘內(nèi)插管 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（0.06 g/kg），頸后部剪毛、消毒，在兩耳連線中央做縱向切口，暴露枕骨寰枕膜，然后從此處插入PE-10管，深6 cm，最終達(dá)到蛛網(wǎng)膜下池，固定PE-10管。甲醛注射前10 min通過(guò)靜脈或鞘內(nèi)注射不同劑量鹽酸奈福泮；舒必利組在鹽酸奈福泮靜脈或鞘內(nèi)注射前10 min注射舒必利。

1.4 大鼠痛行為檢測(cè)

大鼠注射甲醛后表現(xiàn)出特有的退縮反應(yīng)，分為兩期，其中I期是急性傷害性反應(yīng)（0～9 min），直接刺激外周傷害性感受器引起；接著是Ⅱ期（10～60 min），由脊髓背角及外周神經(jīng)元敏感化所致。單位時(shí)間內(nèi)大鼠注射足退縮反應(yīng)次數(shù)作為觀察指標(biāo)。給予大鼠甲醛后即開(kāi)始計(jì)時(shí)，每間隔5 min觀察1次，持續(xù)60 min。

1.5 微透析分析

首先麻醉大鼠，右股靜脈插管注射乳酸林格液（1 ml/h），胸腰椎椎板切除術(shù)后暴露脊髓L3～L5段，大鼠固定于立體定位儀上。按照以往文獻(xiàn)描述，打開(kāi)硬膜后，微透析探針推進(jìn)到脊髓背角淺層，通過(guò)微量注射泵灌注Ringer平衡鹽溶液（1 μl/min），120 min持續(xù)灌注后，連續(xù)采集2個(gè)樣本，通過(guò)高效液相層析法檢測(cè)透析液中多巴胺濃度[6]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或百分?jǐn)?shù)表示。采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析。多組間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni事后檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靜脈及鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮對(duì)大鼠退縮反應(yīng)的影響

對(duì)照組與靜脈注射不同劑量鹽酸奈福泮組大鼠的退縮反應(yīng)次數(shù)，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)大鼠退縮反應(yīng)次數(shù)有差異（F=13.738，P=0.007）；②對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮組退縮反應(yīng)次數(shù)有差異（F=10.482，P=0.012），對(duì)照組退縮反應(yīng)次數(shù)高于不同劑量鹽酸奈福泮組；③對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮組退縮反應(yīng)次數(shù)變化趨勢(shì)有差異（F=9.061，P=0.025）。與對(duì)照組比較，靜脈注射鹽酸奈福泮（3 mg/kg）可使甲醛誘導(dǎo)的I期退縮反應(yīng)次數(shù)降低60%，而Ⅱ期退縮反應(yīng)次數(shù)無(wú)變化（見(jiàn)圖1）。對(duì)照組與不同劑量鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮組大鼠的退縮反應(yīng)次數(shù)，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)大鼠退縮反應(yīng)次數(shù)有差異（F=15.846，P=0.006）；②對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮有差異（F=14.085，P=0.008），對(duì)照組退縮反應(yīng)次數(shù)高于不同劑量鹽酸奈福泮組；③對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮組退縮反應(yīng)次數(shù)變化趨勢(shì)有差異（F=12.972，P=0.012）。鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可使甲醛誘導(dǎo)的2個(gè)階段退縮反應(yīng)降低。其中30 μg鹽酸奈福泮使I期和Ⅱ期退縮反應(yīng)次數(shù)降低49%和44%（見(jiàn)圖2）。

2.2 微透析研究情況

圖1 靜脈注射奈福泮對(duì)甲醛誘導(dǎo)的大鼠退縮反應(yīng)的影響

圖2 鞘內(nèi)注射奈福泮對(duì)甲醛誘導(dǎo)的大鼠退縮反應(yīng)的影響

靜脈注射鹽酸奈福泮后，對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮組的多巴胺水平比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)多巴胺水平無(wú)差異（F=3.731，P=0.064）；②各組的多巴胺水平無(wú)差異（F=3.061，P=0.072）；③各組多巴胺水平變化趨勢(shì)無(wú)差（F=2.843，P=0.083）。鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮后，對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮組不同時(shí)間點(diǎn)的多巴胺水平比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的多巴胺水平有差異（F=13.904，P=0.008）；②對(duì)照組與不同劑量鹽酸奈福泮組在甲醛注射后不同時(shí)間點(diǎn)多巴胺水平有差異（F=11.647，P=0.011），對(duì)照組多巴胺水平低于鹽酸奈福泮組；③對(duì)照組和鹽酸奈福泮組多巴胺水平變化趨勢(shì)有差異（F=15.529，P=0.006）。見(jiàn)圖 3。

2.3 舒必利對(duì)鹽酸奈福泮鎮(zhèn)痛作用的影響

靜脈預(yù)處理舒必利，不影響鹽酸奈福泮對(duì)甲醛模型的鎮(zhèn)痛作用。同樣，鞘內(nèi)注射舒必利，也不影響鹽酸奈福泮對(duì)甲醛模型的鎮(zhèn)痛作用。見(jiàn)圖4。

圖3 靜脈（3 mg/kg）或鞘內(nèi)（30 μg）注射鹽酸奈福泮后脊髓背角細(xì)胞外多巴胺水平

圖4 靜脈（3 mg/kg）或鞘內(nèi)（100 μg）預(yù)注射舒必利對(duì)靜脈（3 mg/kg）或鞘內(nèi)（30 μg）注射奈福泮鎮(zhèn)痛作用的影響

3 討論

本研究顯示，靜脈或鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可減少甲醛引起的疼痛行為。微透析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)而不是靜脈注射鹽酸奈福泮增加脊髓背角細(xì)胞外多巴胺水平。然而，多巴胺D2受體拮抗劑舒必利不影響鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。本結(jié)果表明，奈福泮鎮(zhèn)痛機(jī)制可能不涉及脊髓水平多巴胺能傳遞，雖然奈福泮進(jìn)入脊髓后可抑制多巴胺再攝取。

奈福泮一直被認(rèn)為是單胺類遞質(zhì)（包括多巴胺）再攝取的抑制劑[2]。然而，本研究首次檢測(cè)在體大鼠脊髓背角細(xì)胞外多巴胺水平的變化。由于奈福泮容易通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦內(nèi)，筆者假定靜脈或鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮均會(huì)增加中樞中多巴胺水平。然而，在本研究中，只有鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可使多巴胺水平升高，而靜脈給藥不能增加多巴胺水平。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，靜脈注射鹽酸奈福泮（10 mg/kg）或更高劑量降低甲醛誘導(dǎo)的退縮行為，同時(shí)微透析研究中多巴胺水平也增高，但經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)，如呼吸抑制和（或）死亡等。因此，在目前的研究中，靜脈注射鹽酸奈福泮劑量是3 mg/kg，可能不能完全抑制脊髓多巴胺再攝取?？傊o脈注射奈福泮不能增加脊髓細(xì)胞外多巴胺水平可能由于其注射劑量。另一方面，多巴胺D2受體拮抗劑未減弱鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，雖然鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮可增加脊髓背角細(xì)胞外多巴胺水平。因?yàn)榧顾瓒喟桶纺芟到y(tǒng)已被證明通過(guò)激活D2受體調(diào)節(jié)傷害性信息的傳遞[7]。然而，眾多報(bào)道提示，腦而不是脊髓通路通過(guò)多巴胺能神經(jīng)傳遞參與痛覺(jué)調(diào)節(jié)[8-9]。

鞘內(nèi)注射大劑量D2-受體激動(dòng)劑僅表現(xiàn)短暫的鎮(zhèn)痛作用，而全身注射低劑量該藥物產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用持續(xù)超過(guò)48 h[9]?？偟膩?lái)說(shuō)，腦而不是脊髓通路在多巴胺鎮(zhèn)痛作用中發(fā)揮重要作用。本研究中鞘內(nèi)注射10 μg鹽酸奈福泮量可能僅擴(kuò)散于脊髓水平[10]。因此，鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮不能激活脊髓以上多巴胺通路，從而影響疼痛。因此，筆者推測(cè)多巴胺能調(diào)節(jié)可能不參與鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮的鎮(zhèn)痛機(jī)制。目前多巴胺能系統(tǒng)是否參與奈福泮鎮(zhèn)痛機(jī)制仍存在爭(zhēng)議。有研究指出，多巴胺D2受體拮抗劑舒必利不影響奈福泮在扭體試驗(yàn)中的鎮(zhèn)痛作用[11]。這與本研究的結(jié)果一致。在另一項(xiàng)研究中，3 mg/kg而不是10 mg/kg舒必利阻斷奈福泮在小鼠甲醛模型中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。結(jié)果差異可能是由于研究方法不一樣所致，比如藥物注射途徑、給藥劑量及疼痛類型等，從而通過(guò)腦和（或）脊髓通路發(fā)揮作用。

總之，本研究表明靜脈和鞘內(nèi)注射鹽酸奈福泮均可有效緩解福爾馬林誘導(dǎo)的大鼠炎性疼，然而奈福泮鎮(zhèn)痛機(jī)制可能不涉及脊髓水平多巴胺能傳遞。