鈣蛋白酶抑制劑calpeptin對丙烯酰胺所致神經(jīng)絲磷酸化及相關激酶異常表達的拮抗作用

劉 寧，蘇本玉，管強東，于素芳

（山東大學公共衛(wèi)生學院職業(yè)與環(huán)境健康學系，山東濟南 250012）

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）廣泛應用于各工業(yè)生產(chǎn)活動中，如化妝品制造、污水凈化、油氣開采、礦物洗選、染料合成、制漿造紙和防水管道內涂層等［1-3］。大量的動物實驗研究結果表明，ACR具有神經(jīng)毒性、致癌性、遺傳毒性和生殖毒性［4-7］。相關臨床資料及人群流行病學調查資料顯示，神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀是ACR中毒的主要表現(xiàn)［5］。職業(yè)人群長期暴露于ACR，則發(fā)生ACR慢性中毒，以周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主，發(fā)生感覺-運動型周圍神經(jīng)病，表現(xiàn)為四肢無力、肌痛、深反射減弱或消失及手足套襪型感覺障礙［5］。ACR神經(jīng)毒性的機制與細胞骨架蛋白神經(jīng)絲（neurofilament，NF）磷酸化密切相關［8-9］。NF是神經(jīng)元的中間絲，直徑10 nm，呈柔性且纏繞緊密繩狀聚合物，由3個亞基的多肽構成，高相 對 分 子質量 NF（high neurofilament，NF-H，200 ku）是NF中主要的亞基。蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和PKC在NF磷酸化修飾中發(fā)揮重要作用［10］。鈣蛋白酶（calpain）是一種依賴鈣離子（Ca2+）激活的蛋白水解酶，其作用受體主要包括蛋白激酶、磷酸酶和細胞骨架蛋白等［11］。本課題組研究表明，ACR中毒時，神經(jīng)元內的Ca2+濃度升高，鈣蛋白酶的蛋白活性和含量均相繼升高，磷酸化的NF發(fā)生異常改變［12-14］。本研究觀察鈣蛋白酶抑制劑calpeptin（CP）對ACR中毒的神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSC）PKA，PKC和磷酸化NF-H（phos?phorylated NF-H，p-NF-H）蛋白表達的變化，探討CP對ACR所致NF磷酸化相關激酶表達異常的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

ACR（純度99.9%，美國Sigma-Aldrich公司）；胎牛血清（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；DMEM/F12 1∶1細胞培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；鈣蛋白酶抑制劑CP和兔抗大鼠p-NF-H抗體（德國Merck Millipore公司）；兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）抗體和兔抗大鼠PKA抗體（美國Abcam公司）；兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、兔抗大鼠巢蛋白（nestin）抗體、兔抗大鼠PKC抗體和FITC標記山羊抗兔IgG二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；BCATM蛋白定量試劑盒（美國Pierce Biotechnology公司）；維生素A（上海晶純生化科技公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

M200PRO酶標儀（瑞士Tecan集團公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；Nikon ECLIPSE Ti-U奧林巴斯顯微鏡（日本Nikon公司）；DYY-2C轉移電泳儀、DYY-Ⅲ28A垂直電泳槽及DYY-Ⅲ40B轉移電泳槽（浙江省寧波市新芝生物科技有限公司）；Canoscan 9000F型掃描儀（日本CanoScan公司）；D37520型低溫超速離心機（德國Thermo公司）；VORTEX-5漩渦混合器和TS-8型轉移脫色搖床（中國Qilinbeier公司）。

1.2 原代細胞制備和培養(yǎng)

新生24 h內的Wistar乳大鼠，由山東大學動物中心提供，動物許可證號：SCXK（魯）20130009。將乳大鼠置于75%乙醇中浸泡15 min進行麻醉消毒。用無菌眼科剪剪破其頭頸部皮膚，沿脊柱方向剪開背部皮膚，充分暴露椎骨。將暴露椎體外側隱窩中的脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）用顯微鑷逐個摘取（盡量剔除DRG表面筋膜），用DMEM/F12 1∶1細胞培養(yǎng)基進行NSC原代培養(yǎng)［15］。每天在光學顯微鏡下觀察NSC細胞生長、分裂和增殖。

1.3 原代NSC鑒定

采用免疫熒光染色法測定NSC特異性標志物巢蛋白。經(jīng)維生素A誘導NSC分化后，采用免疫熒光染色法分別測定神經(jīng)元特異性NSE和神經(jīng)膠質細胞特異性GFAP的表達［15］。

1.4 細胞分組和處理

原代NSC培養(yǎng)至第4天，將其分為4組：細胞對照組（僅完全培養(yǎng)基）、CP組（CP 4 μmol·L-1）、ACR 染毒組（ACR 760 μmol·L-1）和 ACR+CP 組（ACR 760 μmol·L-1及 CP 4 μmol·L-1），處理時間為48 h。棄培養(yǎng)基，洗滌3次（去除培養(yǎng)液和非細胞成分），每個培養(yǎng)皿中加入細胞裂解液150 μL，冰上裂解30 min，刮取細胞置于EP管。

1.5 Western蛋白印跡法測定NSC中PKA，PKC和p-NF-H蛋白表達

根據(jù)目的蛋白質相對分子質量選擇不同的分離膠（PKA為 40 ku，PKC 為80 ku，GAPDH 為37 ku，p-NF-H為200 ku）。相對分子質量＜100 ku，選用10%分離膠；相對分子質量＞100 ku，選用7.5%分離膠。PKA，PKC和p-NF-H每組蛋白質上樣量分別為30，40和80 μg。在100 V恒壓條件下，電泳1.5 h。將PVDF膜在甲醇中浸泡3～5 min，電泳結束后，在100 mA恒流條件下，將目的蛋白轉印至PVDF膜上。轉印后，將PVDF膜置于2%脫脂奶粉封閉緩沖液中封閉30 min，棄去封閉液，倒入TBST（含吐溫-20的Tris緩沖液）中洗滌3次，每次5 min。將PVDF膜分別放于抗PKA，PKC，p-NF-H和GAPDH抗體溶液中（抗體稀釋倍數(shù)均為1∶1500），室溫放置1 h，置于冰箱中4℃孵育過夜。從一抗溶液中取出PVDF膜，置于TBST中洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗，室溫放置2 h。在暗室中取出PVDF膜，加入適量ECL發(fā)光液發(fā)光，使用Canoscan9000F掃描儀進行膠片掃描，將圖像保存后，使用捷達凝膠分析系統(tǒng)分析雜交條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA），以目標蛋白條帶與內參GAPDH條帶IA的比值表示目標蛋白相對表達水平［15］。

1.6 免疫熒光法觀察PKA，PKC和p-NF-H在NSC的分布和表達

將各組細胞去除完全培養(yǎng)基，加入PBS 3 mL置于搖床上沖洗蓋玻片3次，每次5 min。取出蓋玻片，加入4℃預冷丙酮，置于4℃冰箱中固定20 min。棄去丙酮，取出蓋玻片重新放置于12孔板中，用PBS沖洗3次。加入適量0.3%Triton X-100處理細胞20 min。PBS沖洗后，用2%BSA溶液封閉15 min。棄去BSA，滴加PKA，PKC和p-NF-H一抗（用PBS按照1∶1000比例稀釋），同時用PBS作為陰性對照，置于4℃冰箱中濕盒孵育過夜。次日，取出蓋玻片置于12孔板中，加入PBS沖洗3次，滴加FITC標記山羊抗兔IgG二抗（用1%BSA 1∶32稀釋），37℃避光孵育45 min。用PBS沖洗后，滴加適量DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚），染色2 min。用緩沖甘油（20%甘油+80%PBS）封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照［15］。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)用±s表示。由SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 原代NSC鑒定

制備的原代NSC體外培養(yǎng)24 h后可貼壁，貼壁后，生長旺盛，6～7 d長滿100 cm2細胞培養(yǎng)平皿底部。圖1所示為培養(yǎng)第1～6天的NSC，表明細胞整體生長狀態(tài)良好。免疫熒光染色顯示，NSC巢蛋白免疫反應陽性，且NSC純度＞90%（圖2）。經(jīng)維生素A誘導，該原代細胞顯示NSE陽性和GFAP陽性，表明所制備的NSC具有分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的潛能，可應用于后續(xù)實驗。

Fig.1 Culture of rat primary neural stem cells（NSCs）.The primary NSCs from the spinal dorsal root ganglion of Wistar rats within 24 h after birth were prepared and cultured in complete medium for 1-6 d.After being cultured for one day，the cells adhered to the culture plates.On the 3rdday（d3），the cells entered a high-speed growth period.The cells were synaptically connected and interwoven into a network lasted until d6.

Fig.2 Identification of primary cultured rat NSCs（Immu?nofluorescence staining）.Nestin expession was positivein NSCs cultured for 48 h only with complete medium.NSCs were cultured in complete medium for 24 h followed with vitamin A 1 μmol·L-1for 7-10 d,and the homologous cells were induced to differentiate into neuron specific enolase（NSE）-positive neurons and glial fibrillary acidic protein（GFAP）-positive glial cells.

2.2 CP對ACR致NSC中PKA，PKC和p-NF-H蛋白表達水平的影響

如圖3所示，與細胞對照組相比，ACR組NSC中PKA蛋白表達下降41.6%（P＜0.05），PKC蛋白表達下降29.4%（P＜0.05），而p-NF-H蛋白表達升高66.4%（P＜0.05）；CP組三者均無明顯變化。與ACR組相比，ACR+CP組的PKA蛋白表達升高68.9%（P＜0.05），PKC蛋白表達升高34.4%（P＜0.05），而p-NF-H蛋白表達下降18.6%（P＜0.05）。與CP組相比，ACR+CP組PKA，PKC和p-NF-H蛋白表達無明顯變化。

2.3 CP對ACR致NSC中PKA，PKC和p-NF-H分布和表達的影響

圖4和圖5所示，與細胞對照組相比，CP組NSC中PKA和PKC熒光強度變化不明顯；ACR組NSC數(shù)量減少，形態(tài)異常，NSC中PKA和PKC熒光強度減少且分布不均勻。與ACR組相比，ACR+CP組NSC數(shù)量增多，形態(tài)趨于正常，NSC中PKA和PKC熒光強度升高且分布均勻。與CP組相比，ACR+CP組PKA和PKC變化不明顯。

Fig.3 Effect of calpeptin（CP）on protein content of protein kinase A（PKA）（A），PKC（B）and phosphory?lated high neurofilament（p-NF-H）（C）in primary cultured rat NSCs induced by acrylamide（ACR）detected with Western blotting.The primary NSCs were cultured for 4 d and cultured with CP 4 μmol·L-1，ACR 760 μmol·L-1or CP 4 μmol·L-1+ACR 760 μmol·L-1for another 48 h.A2，B2 and C2 was the semiquantitive results of A1，B1 and C1，respectively.IA：integrated absorbance.±s，n=10.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with ACR group.

圖6所示，與細胞對照組相比，CP組NSC中熒光強度相近，且p-NF-H主要分布于胞體核周部位；ACR組熒光強度增加，軸突中亦有分布。與ACR組相比，ACR+CP組熒光強度減弱，軸突中少量存在。與CP組相比，ACR+CP組熒光強度相近，軸突中亦有少量分布。

Fig.5 Effect of CP on distribution and expression of PKC in primary cultured rat NSCs induced by ACR（Immunofluorescence staining）.See Fig.3 for the cell treat?ment.In cell control group,PKC was uniformly distributed within the NSCs（▲）.In CP group,PKC was uniformly distributed within the NSCs（▲）.In ACR group,the number of NSCs decreased and the morphology was abnormal.The fluorescence intensity of PKC in NSCs was decreased and unevenly distributed（■）.In ACR+CP group，the number of NSCs was increased and the morphology tended to be normal.The fluorescence intensity of PKC in NSCs was increased and evenly distributed（★）.

Fig.6 Effect of CP on distribution and expression of p-NF-H in primary cultured rat NSCs induced by ACR（Immuno?fluorescence staining）.See Fig.3 for the cell treatment.In cell control group,p-NF-H was mainly distributed in the perinuclear region of the cell body within the NSCs（▲）.In CP group,p-NF-H was mainly distributed in the perinuclear region of the cell body within the NSCs（▲）.In ACR group，the fluorescence intensity of p-NF-H in NSCs was increased and also distributed in the axon（■）.In ACR+CP group，the fluorescence intensity of p-NF-H in NSCs was decreased and present in small amounts in axons（★）.

3 討論

NSC是一種多功能干細胞，具有分化潛能，可應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病及治療機制研究［16］。本研究制備的大鼠原代NSC用DMEM/F12 1∶1細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，從第3天開始，細胞進入高速生長期，可延續(xù)至第6或第7天。因此，本研究選培養(yǎng)第4天的細胞進行后續(xù)實驗。

據(jù)報道，未分化的NSC可特異性表達巢蛋白，并且巢蛋白的表達隨著細胞的成熟呈進行性下降［17］。體外培養(yǎng)的NSC可誘導分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，兩者分別特異性地表達NSE和GFAP。本研究用免疫熒光染色顯示，在細胞核周圍，巢蛋白免疫反應陽性的細胞＞90%，說明所制備的NSC純度＞90%。另經(jīng)維生素A誘導后，兩者均呈陽性，表明所制備的NSC具有分化潛能，此細胞可應用于后續(xù)實驗。

NF的磷酸化修飾是由相關蛋白激酶及磷酸酶共同調節(jié)完成，且其磷酸化狀態(tài)隨NF組裝、運輸及解聚過程發(fā)生動態(tài)改變［18］。PKA和PKC作為多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，并在各種神經(jīng)元胞質和胞膜上有廣泛存在。PKA主要是由2個基團構成，即調節(jié)亞基和催化亞基，催化亞基具有整個酶的催化活性。PKC是由Ca2+和磷脂依賴激活的蛋白激酶。PKA和PKC可作用于NF頭部的磷酸化，使NF的組裝能正常進行［19］。本研究結果顯示，與細胞對照組相比，CP組PKA，PKC和p-NF-H蛋白表達水平并未發(fā)生顯著改變，提示CP單獨作用時相關激酶并無明顯改變；ACR組PKA和PKC蛋白表達水平下降，p-NF-H蛋白表達水平升高，提示在ACR中毒時可能由于鈣蛋白酶對PKA和PKC的水解作用加強，使NF無法進行正常的磷酸化，NF的組裝發(fā)生障礙，導致p-NF-H亞基增多。與ACR組相比，ACR+CP組PKA和PKC蛋白表達水平增加，p-NF-H蛋白表達水平減少，提示CP可能通過抑制鈣蛋白酶的活性，從而使PKA和PKC蛋白表達增加，使NF磷酸化并恢復組裝，p-NF-H亞基減少。免疫熒光實驗結果表明，PKA和PKC在細胞內分布不均勻且亮度低，可能是ACR導致鈣蛋白酶的活性異常升高，從而使PKA和PKC蛋白降解所致。p-NF-H表達增加且軸突亦有分布，可能是由于PKA和PKC的異常改變導致NF的磷酸化異常，從而導致NF組裝、運輸及解聚發(fā)生故障，最終引起細胞骨架破壞，細胞死亡。

綜上所述，在細胞水平上，ACR可導致NSC中PKA和PKC的蛋白水平降低，p-NF-H蛋白水平增加；CP對ACR導致的上述變化有拮抗作用。