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    PF-4708671和NVP-BEZ235聯(lián)合用藥協(xié)同抑制MDA-MB-436和A549細(xì)胞增殖

    2019-01-08 06:07:12彭培佩晨3李山虎
    關(guān)鍵詞:西羅莫司激酶

    彭培佩*,王 ?。?,陳 晨3,,黃 芳,王 芃,李山虎,王 輝

    (1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室,廣東廣州 510006;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所細(xì)胞工程實驗室,北京 100850;3.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南洛陽 471023;4.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部,北京 100083)

    p70核糖體S6激酶β-1(ribosomal protein S6 kinase beta-1,S6K1)屬于蛋白激酶A/蛋白激酶G/蛋白激酶C家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與調(diào)節(jié)西羅莫司(雷帕霉素)復(fù)合物1〔mammalian target of sirolimus(Rapamycin)complex 1,mTORC1〕蛋白激酶下游的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長[1-2],而作為40S核糖體亞基組成部分的S6蛋白是S6K1最重要的底物之一[3]。通常認(rèn)為,mTORC1-S6K1信號軸調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成、細(xì)胞生長和細(xì)胞代謝等過程。因此,S6K1在包括肥胖、糖尿病、衰老和癌癥等許多疾病中起重要作用,研究者已提出通過抑制該激酶活性來治療癌癥和胰島素抗性的策略[4-5]。

    PF-4708671是S6K1的特異性抑制劑,通過誘導(dǎo)依賴于mTORC1的S6K1的T環(huán)和疏水基序的磷酸化,進(jìn)而抑制S6K1底物S6蛋白的磷酸化[6]。研究表明,PF-4708671能抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ,導(dǎo)致線粒體功能異常,并誘導(dǎo)過量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,通過激活胱天蛋白酶或釋放細(xì)胞色素c,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6-8]。另外,最近的研究還發(fā)現(xiàn),PF-4708671也可通過減少抗凋亡蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)對他莫昔芬耐藥的MCF-7細(xì)胞死亡[9-11]。

    磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和mTOR信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的傳導(dǎo)通路之一,與細(xì)胞生長、增殖和凋亡密切相關(guān)[12]。PI3K/AKT/mTOR信號通路在多種癌癥中被激活,其激活機(jī)制包括腫瘤抑制因子磷酸酶和張力蛋白同源性(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因功能的喪失、PI3K的擴(kuò)增或突變、AKT的擴(kuò)增或突變和生長因子受體的激活等[13]。一系列臨床研究均表明,mTOR激酶抑制劑(如西羅莫司及其衍生物依維莫司等)可用于治療如食管鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、腎細(xì)胞癌和前列腺癌等實體瘤,而許多PI3K/AKT/mTOR信號分子的靶向性藥物也正處于臨床前開發(fā)或早期臨床試驗階段[13-14]。但臨床試驗也發(fā)現(xiàn),mTOR激酶抑制劑西羅莫司和依維莫司在抑制S6K1活性的同時能反饋激活A(yù)KT信號通路,繼而通過調(diào)控Bcl-2、叉頭框蛋白家族因子、凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)、胱天蛋白酶9、糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)、結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2(tuberous sclerosis complex 2,TSC-2)等分子活性抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖等作用減弱治療效果[15-17]。為此,本研究通過探索S6K1抑制劑PF-4708671調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路的作用機(jī)制,提出與NVP-BEZ235聯(lián)合用藥的策略,以期對腫瘤靶向性治療臨床用藥提供有益的線索。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和主要儀器

    感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-436和肺癌細(xì)胞A549購自美國ATCC;西羅莫司(sirolimus)、PF-4708671和NVP-BEZ235購于美國Selleck公司;山羊抗微管蛋白(γ-Tubulin)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;兔抗磷酸化AKT473(p-AKT473),p-S6,AKT和S6K1多克隆抗體均購于美國Cell Signaling公司;山羊抗兔和兔抗山羊IgG抗體購于北京中杉金橋生物公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司;二甲亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司;胎牛血清購于杭州四季青公司;青霉素和鏈霉素購于華北制藥有限公司;嘌呤霉素購于美國HyClone公司;蛋白酶抑制劑和甲紫(結(jié)晶紫)購于美國Amresco公司;BCA蛋白定量試劑盒、CO2恒溫培養(yǎng)箱和MULTISKAN FC酶標(biāo)儀均購自美國Thermo公司;ECL發(fā)光液購于北京天根生化科技有限公司;Cell Counting Kit 8(CCK8)試劑盒購于東仁化學(xué)科技有限公司;Lipo3000試劑盒購于賽默飛世爾中國;5417R低溫高速離心機(jī)及5418臺式室溫離心機(jī)購于德國Eppendorf公司;電泳槽和濕轉(zhuǎn)膜儀購于美國Biorad公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    MDA-MB-436和A549細(xì)胞均用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1和鏈霉素0.1 g·L-1的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長密度長到80%~90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

    根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[18],利用PLKO.1載體設(shè)計干擾S6K1表達(dá)的短發(fā)夾RNA(sh-S6K1),引物序列為F:CC?GGGCATCGGCACCACTTCCAATACTCGAGTATT?GGAAGTGGTGCCGATGCTTTTTG;R:AATTCAAAAAGCATCGGCACCACTTCCAATACTCGAGTATTGGAAGTGGTGCCGATGC。引物由北京賽百盛生物工程公司合成,4℃保存。使用PLKO.1載體按膠回收試劑盒(Axygen公司)說明書進(jìn)行酶切回收,將設(shè)計的短序列進(jìn)行退火連接,將載體片段和退火片段通過T4連接酶進(jìn)行連接,將連接產(chǎn)物利用大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化,涂氨芐平板,挑單克隆搖菌,按質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen公司)說明書提取質(zhì)粒,并測定濃度,-20℃保存。送生物工程(上海)股份有限公司北京測序部得到測序結(jié)果。按照Lipo3000試劑盒說明書操作,獲得穩(wěn)定敲低S6K1表達(dá)的MDA-MB-436和A549細(xì)胞。

    1.4 Western蛋白印跡法檢測p-AKT473,AKT和S6K1蛋白水平

    在接種MDA-MB-436和A549細(xì)胞的培養(yǎng)皿內(nèi)加入終濃度為30 μmol·L-1的PF-4708671,處理0,1,3,6,12和24 h后收取細(xì)胞;以及單獨或聯(lián)合加入PF-4708671(30 μmol·L-1)或西羅莫司(10 nmol·L-1)處理24 h后收取細(xì)胞;向接種敲低S6K1的上述2種細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入終濃度為30 μmol·L-1的PF-4708671,處理24 h后收取細(xì)胞;以及單獨或聯(lián)合加入 PF-4708671 30 μmol·L-1或 NVP-BEZ235 100 nmol·L-1,處理24 h后收取細(xì)胞;用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞,利用BCA比色法在酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度(A570nm)值,測定標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白樣品的濃度。向蛋白樣品中加入5×SDS加樣緩沖液并煮沸8 min,對蛋白進(jìn)行預(yù)變性處理。以10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后,在濕轉(zhuǎn)裝置中以200 mA進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h,在5%脫脂奶粉中封閉約30 min。使用5%的脫脂奶粉稀釋一抗(p-AKT473,AKT和S6稀釋比例為1∶1000,p-S6稀釋比例為1∶3000),在4℃的搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次后加入二抗(稀釋比例1∶5000)室溫孵育6 h,之后用TBST洗膜3次,每次5 min,以ECL法顯影及定影。膠片經(jīng)掃描后用Image J進(jìn)行積分吸光度分析。

    1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞存活

    將處于對數(shù)生長期的上述2種細(xì)胞消化后,按每孔分別3500和2500細(xì)胞接種到96孔板中,每孔重復(fù)3次,置于CO2培養(yǎng)箱24 h后,各孔單獨加入0,10,20,30和40 μmol·L-1的PF-4708671或聯(lián)合加入 NVP-BE235(MDA-MB-436:8 nmol·L-1;A549:1 μmol·L-1)抑制劑72 h后去除原孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入100 μL稀釋后的CCK8工作液(按CCK8原液與培養(yǎng)液1∶9的比例配制)繼續(xù)孵育2 h,而后利用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度(A450nm)值,細(xì)胞存活率(%)=(加藥組A450nm-空白組A450nm)/(正常對照組A450nm-空白組A450nm)×100%。實驗重復(fù)3次。

    1.6 平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖

    將處于對數(shù)生長期的上述2種細(xì)胞按每孔3000細(xì)胞接種到6孔板內(nèi),待孔內(nèi)細(xì)胞克隆生長到一定大小時,單獨或聯(lián)合加入PF-4708671(30 μmol·L-1)和NVP-BEZ235(100 nmol·L-1),6 d后去除原培養(yǎng)液,加入PBS洗滌3次,加入甲醇固定細(xì)胞層約30 min,加入甲紫染液染色30 min,用流水緩慢清洗孔內(nèi)剩余染料后放置于室內(nèi)風(fēng)干。顯微鏡下計數(shù)≥10個細(xì)胞的克隆數(shù)。實驗重復(fù)3次取平均值。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

    計量資料以±s表示。使用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析,Studentt檢驗(或校正t檢驗)用于兩組間比較;單因素方差分析進(jìn)行多組比較,P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用Chou-Talalay方法分析聯(lián)合用藥后的聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI),定量描述聯(lián)合用藥的相加作用(CI=1)、協(xié)同作用(CI<1)以及拮抗作用(CI>1)。

    2 結(jié)果

    2.1 PF-4708671對MDA-MB-436和A549細(xì)胞中p-S6及AKT表達(dá)水平的影響

    Western蛋白印跡結(jié)果(圖1)顯示,PF-4708671 30 μmol·L-1作用于上述2種細(xì)胞后,p-S6蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),而p-AKT473蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.01),同時AKT總蛋白表達(dá)水平無明顯差異(圖1A,C)。表明S6K1抑制劑PF-4708671抑制上述2種細(xì)胞中S6磷酸化水平的同時能反饋激活A(yù)KT活性。

    Fig.1 Effect of PF-4708671(PF)on protein expression levels of protein kinase B(AKT),p-AKT473,S6 and p-S6 in MDA-MB-436(A,B)and A549(C,D)cells by Western blotting.Cells were treated with PF 30 μmol·L-1for 0,1,3,6,12 and 24 h,respectively.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C,respectively.IA:integrated absorbance.±s,n=3.**P<0.01,compared with p-AKT473 in 0 h group;##P<0.01,compared with p-S6 in 0 h group.

    2.2 PF-4708671和西羅莫司聯(lián)用對MDA-MB-436和A549細(xì)胞中p-S6及AKT表達(dá)水平的影響

    Western蛋白印跡結(jié)果(圖2)顯示,單用或聯(lián)用mTOR抑制劑西羅莫司10 nmol·L-1和PF-4708671 30 μmol·L-1作用上述2種細(xì)胞,均能抑制p-S6活性并導(dǎo)致AKT反饋激活(P<0.01);當(dāng)兩者聯(lián)用時,對p-S6活性有進(jìn)一步的抑制(P<0.01),且進(jìn)一步激活了AKT活性(P<0.01),AKT總蛋白表達(dá)水平無明顯差異(圖2A,C)。表明在上述2種細(xì)胞中,西羅莫司和PF-4708671在抑制S6K1活性的同時都能導(dǎo)致AKT反饋激活,且具有疊加作用。

    2.3 PF-4708671對敲低S6K1的MDA-MB-436和A549細(xì)胞中S6K1及AKT表達(dá)水平的影響

    Western蛋白印跡結(jié)果(圖3)顯示,敲低S6K1后,ATK活性相較于野生型細(xì)胞明顯上升(P<0.01);用PF-4708671作用野生型細(xì)胞時,能導(dǎo)致p-AKT473表達(dá)水平顯著增加(P<0.01),但用PF-4708671作用于敲低S6K1后的上述2種細(xì)胞時,其對p-AKT473的表達(dá)水平增加的程度明顯低于PF-4708671作用野生型細(xì)胞中p-AKT473增加的水平(P<0.01)(圖3E),同時AKT總蛋白表達(dá)水平無明顯差異(圖3A,C)。這一研究表明,敲低S6K1后的確能顯著增加p-AKT473表達(dá)水平,同時PF-4708671可通過抑制S6K1激活A(yù)KT活性。

    Fig.2 Effect of PF combined with sirolimus(Sir)on protein expression levels of p-AKT473,AKT,S6 and p-S6 in MDA-MB-436(A,B)and A549(C,D)cells by Western blotting.Cells were treated with PF(30 μmol·L-1,24 h)and Sir(10 nmol·L-1,24 h)alone or in combination.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C,respectively.±s,n=3.**P<0.01,compared with corresponding normal control(NC)group.

    Fig.3 Effect of PF on ribosomal protein S6 kinase beta-1(S6K1)and p-AKT473 expression levels in MDA-MB-436(A,B)and A549(C,D)cells after S6K1 was knocked down by small interfering RNA(sh-S6K1)by Western blotting.The sh-S6K1 cells were treated with PF 30 μmol· L-1for 24 h.B and D was the semi-quantitative analysis of A and C,respectively.E was the changes in p-AKT473 expression in wild-type(WT)and sh-S6K1 cells after being treated with PF,and was the semi-quantitative analysis of A and C.±s,n=3.**P<0.01,compared with corresponding NC group;△△P<0.01,compared with corre?sponding WT group.

    2.4 PF-4708671聯(lián)合NVP-BEZ235對MDA-MB-436和A549克隆形成和細(xì)胞存活的影響

    Western蛋白印跡結(jié)果(圖4)顯示,PI3K/mTOR雙重抑制劑NVP-BEZ235可顯著抑制由PF-4708671所導(dǎo)致的p-AKT473活性增強(qiáng)(P<0.01)。平板克隆結(jié)果(圖5A-D)顯示,與單用PF-4708671或NVP-BEZ235相比,兩者聯(lián)合處理后MDA-MB-436及A549細(xì)胞的克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.01)。CCK8結(jié)果(圖5E,F(xiàn))表明,與正常對照組相比,單用PF-4708671及NVP-BEZ235均具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的效果(P<0.01),但2種抑制劑聯(lián)用時,顯著增強(qiáng)了抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用(P<0.01),且兩藥聯(lián)用存在協(xié)同作用(CI<1)。

    Fig.4 Effect of PF combined with NVP-BEZ235(BEZ)on expression levels of AKT,p-AKT473,S6 and p-S6 kinase in MDA-MB-436(A,B)and A549(C,D)cells by Western blotting.The cells were treated with PF(30 μmol·L-1,24 h)and BEZ(100 nmol·L-1,4 h).B and D was the semi-quantitative analysis of A or C,respectively.±s,n=3.**P<0.01,compared with corresponding NC group.

    Fig.5 Effect of PF combined with BEZ on clonal formation and cell survival of MDA-MB-436(A,B,E)and A549(C,D,F(xiàn)).A and C:the cells were treated with PF(MDA-MB-436:20 μmol·L-1;A549:60 μmol·L-1)and BEZ(MDA-MB-436:8 nmol·L-1;A549:20 nmol·L-1)alone or in combination for cloning experiment respectively.B and D:count analysis of each hole for A and C.E and F:the cells were treated with the indicated concentrations gradient of PF with BEZ(MDA-MB-436:8 nmol·L-1;A549:1 μmol·L-1)alone or in combination for cell survival assay.±s,n=3.*P<0.05,**P<0.01,compared with NC group;#P<0.05,##P<0.01,compared with PF+BEZ group.

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),S6K1抑制劑PF-4708671和PI3K/mTOR激酶抑制劑NVP-BEZ235聯(lián)用于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-436和肺癌細(xì)胞A549,可顯著增強(qiáng)單用時對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。

    PI3K/AKT/mTOR信號通路與多種癌癥的發(fā)生有關(guān),因而被認(rèn)為是靶向性治療的有效靶點,但是常常由于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTK)信號增強(qiáng),或和其他促生長信號通路之間的交互作用,導(dǎo)致耐藥性和不良預(yù)后的發(fā)生[19-21]。

    PI3K/AKT/mTOR信號通路激活下游的S6K1以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖[22]。有研究發(fā)現(xiàn),激活的S6K1可抑制PI3K上游調(diào)控分子胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)的功能活性,導(dǎo)致PI3K/AKT通路無法被正常激活而表現(xiàn)出一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制[2]。因此,當(dāng)用西羅莫司抑制mTORC1會解除S6K1反饋抑制環(huán)路而導(dǎo)致AKT的持續(xù)激活,使得腫瘤細(xì)胞對西羅莫司產(chǎn)生耐藥性,減弱其潛在的抗癌活性[23]。但也有研究對此結(jié)論提出了質(zhì)疑。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn),用S6K1抑制劑或者直接敲低S6K1表達(dá)都不能激活A(yù)KT活性,進(jìn)而認(rèn)為西羅莫司或mTORC1抑制劑不是通過解除IRS-1/PI3K/AKT信號通路的負(fù)反饋調(diào)控來激活A(yù)KT活性。而本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),S6K1抑制劑PF-4708671和西羅莫司具有相似的作用分子機(jī)制,都可以通過抑制S6K1活性來激活A(yù)KT活性。本研究首先發(fā)現(xiàn),用S6K1抑制劑PF-4708671處理MDA-MB-436和A549細(xì)胞后抑制S6K1活性同時相應(yīng)激活了AKT活性;而通過敲低腫瘤細(xì)胞中S6K1表達(dá),可直接上調(diào)AKT磷酸化水平,說明S6K1直接參與了負(fù)調(diào)控ATK活性。同時發(fā)現(xiàn),在敲低S6K1表達(dá)的突變型細(xì)胞中,PF-4708671依然能激活A(yù)KT活性;但相對于野生型細(xì)胞而言,PF-4708671對ATK的激活程度顯著減弱,這都提示PF-4708671激活A(yù)KT活性的分子機(jī)制可能是通過抑制S6K1活性來實現(xiàn)的。

    由于AKT的激活經(jīng)常與細(xì)胞生存和抗癌治療有關(guān),因而認(rèn)為PF-4708671作用下的AKT激活也會減弱PF-4708671的抗腫瘤作用。因此,本研究首先證實PF-4708671對AKT的反饋激活可被PI3K和mTOR雙重ATP競爭性抑制劑NVP-BEZ235所阻斷,在此基礎(chǔ)上提出了聯(lián)合用藥的策略。研究結(jié)果證實,在PF-4708671和NVP-BEZ235聯(lián)用時顯著增強(qiáng)PF-4708671單用對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。因此,對于PI3K/AKT/mTOR信號通路異常激活所導(dǎo)致的腫瘤,可通過聯(lián)用S6K1抑制劑和PI3K/AKT抑制劑來增強(qiáng)靶向性治療的效果。

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