巨噬細(xì)胞極化在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的作用

張思敏 亓發(fā)芝

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院整形外科,上海 200031)

病理性瘢痕是皮膚網(wǎng)狀真皮層損傷后，在愈合過程中以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)合成大于分解導(dǎo)致過度沉積的一種真皮纖維化疾病。病理性瘢痕區(qū)別于正常瘢痕(又稱成熟瘢痕)，它主要包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。病理性瘢痕嚴(yán)重影響美觀、皮膚功能及患者心理體驗(yàn)，然而其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未闡釋清楚。

巨噬細(xì)胞是皮膚損傷時(shí)繼血小板和中性粒細(xì)胞后較早到達(dá)創(chuàng)傷處的免疫細(xì)胞，在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要作用，日益受到研究者重視。創(chuàng)傷愈合的三個(gè)階段“炎癥反應(yīng)、組織增生、修復(fù)重建”中，巨噬細(xì)胞不僅在炎癥過程中清除細(xì)胞碎片，而且在增殖過程中促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及新生血管形成，在重建過程中調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞完成修復(fù)后死亡和血管退化[1]。已有研究顯示，巨噬細(xì)胞與創(chuàng)傷愈合和病理性瘢痕有關(guān)。

1 巨噬細(xì)胞的極化分型

巨噬細(xì)胞主要分為M1型和M2型，M1型又稱經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞，M2型又稱選擇性活化巨噬細(xì)胞，M2型巨噬細(xì)胞又分為M2a、M2b、M2c，它們具有不同的細(xì)胞表面受體，胞內(nèi)存在不同的酶，分泌不同的細(xì)胞因子。

根據(jù)巨噬細(xì)胞所處的微環(huán)境和疾病狀態(tài)不同，M1和M2可在環(huán)境因素的作用下相互轉(zhuǎn)化，未分型的單核細(xì)胞也可發(fā)生向M1或M2的極化[2]。巨噬細(xì)胞可在IFN-γ、損傷相關(guān)分子模式(Damage associated molecular pattern,DAMP)、病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等刺激下極化為M1，其中脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是最常見、最經(jīng)典的一種PAMP。M1分泌高水平的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12和IL-23[3,4]。巨噬細(xì)胞也可在一些條件刺激下極化為M2型，其中，在IL-4和IL-13的刺激下極化為M2a型，在IL-1和LPS的刺激下極化為M2b型，在IL-10和TGF-β的刺激下極化為M2c型。M2分泌高水平TGF-β、IL-10、結(jié)締組織生長因子和纖連蛋白[3,4]。

2 巨噬細(xì)胞與病理性瘢痕的關(guān)系

2.1巨噬細(xì)胞與病理性瘢痕的關(guān)系 病理性瘢痕在成人中出現(xiàn)，而不發(fā)生于胎兒。胎齡33周以前的胎兒皮膚組織中可觀察到，CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量少且功能尚未發(fā)育成熟，而成人皮膚組織中成熟的巨噬細(xì)胞明顯增多[5,6]。成人增生性與非病理性瘢痕對比研究顯示，增生性瘢痕中存在較多CD68+巨噬細(xì)胞，而非病理性瘢痕中巨噬細(xì)胞較少，說明巨噬細(xì)胞可促進(jìn)增生性瘢痕形成[7]。

對正常皮膚、增生性瘢痕(<6個(gè)月)、增生性瘢痕(6～12個(gè)月)、瘢痕疙瘩和成熟性瘢痕(>8年)進(jìn)行比較，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中巨噬細(xì)胞明顯多于正常皮膚；增生性瘢痕(<6個(gè)月)與增生性瘢痕(6～12個(gè)月)沒有明顯差異，但均顯著多于成熟性瘢痕；瘢痕疙瘩與增生性瘢痕(<6個(gè)月)相比，巨噬細(xì)胞明顯較少，瘢痕疙瘩與增生性瘢痕(6～12個(gè)月)相比差異不大；瘢痕疙瘩與成熟性瘢痕相比明顯較多，以上結(jié)果提示巨噬細(xì)胞與增生性瘢痕的不同時(shí)期和瘢痕疙瘩的相關(guān)性不同[8]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，缺乏中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞PU.1基因的敲除小鼠中，炎癥反應(yīng)缺失，TGF-β減少，愈合加快，說明巨噬細(xì)胞的缺失可促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合[6]。由此可見，人和動(dòng)物中巨噬細(xì)胞與病理性瘢痕的形成密切相關(guān)。

文獻(xiàn)表明，病理性瘢痕與非病理性瘢痕中14種基因表達(dá)存在明顯差異：①促炎因子3種：TNF-α，IL-1α，IL-1RN；②炎性因子5種：C3，CCL2，CCL3，CXCL2，CXCR2；③抗炎因子2種：TGF-β3，IL-10；④血管生成相關(guān)1種：重組人血管生成素1；⑤細(xì)胞外基質(zhì)沉積相關(guān)2種：Ⅲ型膠原，尿激酶型纖溶酶原激活物(PLAU)；⑥適配子1種：磷脂酶A2[7]。其中病理性瘢痕較非病理性瘢痕表達(dá)上升的為PLAU，TGF-β3，其余11種均表達(dá)下降。同時(shí)，病理性瘢痕中M2出現(xiàn)較晚(第4周)，且到第6周才下降，這種M2的趨化延遲可能與病理性瘢痕中上述炎性因子減少有關(guān)[7]。

2.2巨噬細(xì)胞極化與病理性瘢痕的關(guān)系 先前研究主要是關(guān)于巨噬細(xì)胞與病理性瘢痕的關(guān)系，而很少將巨噬細(xì)胞按不同分型予以討論。近些年來，開始有研究探討巨噬細(xì)胞的極化分型與創(chuàng)傷愈合或病理性瘢痕的關(guān)系。

研究顯示，與正常創(chuàng)傷愈合相比，增生性瘢痕中M2明顯增多[9]。與非病理性瘢痕相比，增生性瘢痕中存在較多CD163+M2，出現(xiàn)延遲但浸潤時(shí)間延長[10]。與正常皮膚相比，瘢痕疙瘩中CD14+M2明顯增多，且TGF-β、IL-10、IL-12、iNOS轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著升高，提示瘢痕疙瘩中M2相關(guān)基因表達(dá)明顯高于M1，說明增多的M2在瘢痕疙瘩形成中發(fā)揮主要作用[10]。

在皮膚創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成的不同階段去除或敲除巨噬細(xì)胞，呈現(xiàn)出不同結(jié)果。運(yùn)用兔耳瘢痕模型，術(shù)前1 d與術(shù)后1 d用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體早期去除全身單核巨噬細(xì)胞[11]。與對照組比較，去除組愈合總時(shí)間明顯縮短，細(xì)胞增殖更活躍，但愈合后去除組的增生性瘢痕更明顯，瘢痕增生指數(shù)更高，真皮組織細(xì)胞數(shù)量更多，說明早期去除巨噬細(xì)胞可減少創(chuàng)面愈合總時(shí)間、促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但增加瘢痕形成。

在愈合的不同階段用白喉毒素，運(yùn)用LysMCre/iDTR小鼠制造皮膚創(chuàng)面模型：①早期(炎癥時(shí)期)敲除導(dǎo)致早期的愈合延遲。然而在后期，早期敲除組較對照組愈合更好，但血管化、上皮化減少，瘢痕組織范圍和收縮力更小。說明早期巨噬細(xì)胞在創(chuàng)傷發(fā)生后立即促進(jìn)富含血管的肉芽組織、肌成纖維細(xì)胞形成以及創(chuàng)面收縮，發(fā)揮早期促愈合的積極作用；敲除后延遲早期愈合，但從愈合全過程來看，早期敲除促進(jìn)創(chuàng)面愈合，與前述用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體去除早期巨噬細(xì)胞結(jié)果一致；而關(guān)于早期去除或敲除巨噬細(xì)胞對瘢痕形成的影響，與前述相反，反映出巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面愈合與瘢痕形成中功能的復(fù)雜性。②中期(組織形成期)去除巨噬細(xì)胞導(dǎo)致創(chuàng)面出血，難以愈合。③晚期(組織成熟期)去除巨噬細(xì)胞不影響愈合與修復(fù)，說明晚期巨噬細(xì)胞對組織成熟與瘢痕形成的作用不大[12]。

CXCL12，對淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞具有強(qiáng)烈趨化作用，其特異性受體為CXCR4，存在于大部分組織和器官的細(xì)胞表面，其中包含單核-巨噬細(xì)胞。臨床研究顯示，在燒傷導(dǎo)致的病理性瘢痕中，CXCL12/CXCR4信號通路增強(qiáng)，皮下局部應(yīng)用IFNα2b，該通路下調(diào)、瘢痕組織重建[13]。

2.3M1/M2型巨噬細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子影響病理性瘢痕形成 M1主要分泌TNF-α。增生性瘢痕形成早期，瘢痕內(nèi)TNF-α表達(dá)較正常皮膚組織低下，提示TNF-α含量降低與增生性瘢痕形成有關(guān)，隨著增生性瘢痕的組織成熟，TNF-α含量明顯逐漸升高，但仍低于正常皮膚[14]。結(jié)合前文所述用脂質(zhì)體去除早期M1導(dǎo)致瘢痕形成增加的結(jié)果，提示去除M1引起的TNF-α分泌減少可能是影響瘢痕形成的重要因素。

M2a和M2c主要分泌TGF-β，M2a還可分泌CTGF。TGF-β在前2/3孕期的胎兒皮膚中表達(dá)水平較低，正常成人皮膚中幾乎不表達(dá)，瘢痕中明顯高表達(dá)，而在成熟瘢痕中低表達(dá)，這種TGF-β表達(dá)狀態(tài)的差異可能也與瘢痕形成有關(guān)，提示病理性瘢痕的形成可能與M2分泌的TGF-β增多有關(guān)[15,16]。TGF-β/Smad/CTGF信號通路是增生性瘢痕形成的經(jīng)典信號通路之一，通過多種方式抑制該通路，可明顯減輕瘢痕形成[17,18]。同時(shí)，由巨噬細(xì)胞分泌或其他來源的TGF-β也可作用于巨噬細(xì)胞，從而影響瘢痕形成。TGF-β的趨化作用可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向創(chuàng)傷處移動(dòng)[19]。

M2型還可分泌血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)[2]。VEGF在正常皮膚組織中低表達(dá)，而在瘢痕疙瘩中表達(dá)明顯持續(xù)性增高，提示VEGF升高可能與瘢痕疙瘩形成有關(guān)[19]。巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1和VEGF，可促進(jìn)上皮細(xì)胞存活。敲除小鼠創(chuàng)傷愈合中期的巨噬細(xì)胞，由于缺乏TGF-β1和VEGF，可觀察到上皮細(xì)胞凋亡和血管失穩(wěn)，說明創(chuàng)傷愈合中期的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)血管化、上皮化[12，20,21]。淋巴管形成在創(chuàng)傷愈合中具有重要作用，抑制COX-2或缺失EP3、EP4，導(dǎo)致M2的募集減少，M2產(chǎn)生VEGF-C/D減少，從而影響創(chuàng)傷愈合[22]。

血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)主要由血小板α顆粒貯存并分泌，當(dāng)皮膚組織受損時(shí)，M2成為合成并分泌PDGF的主要細(xì)胞之一，同時(shí)，巨噬細(xì)胞表面存在PDGF受體，可受PDGF的影響和調(diào)節(jié)。研究顯示，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中，PDGF-A和PDGF-B的含量明顯多于正常皮膚，通過誘導(dǎo)微血管生成從而促進(jìn)病理性瘢痕形成[23]。由巨噬細(xì)胞分泌或其他來源的PDGF還可結(jié)合巨噬細(xì)胞的PDGF受體，激活并趨化巨噬細(xì)胞至損傷處，通過進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生過多膠原，PDGF也可直接作用于成纖維細(xì)胞表面的PDGF受體，促進(jìn)其活動(dòng)[24]。PDGF也可通過促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑-1表達(dá)，從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-1對多余膠原的降解作用，導(dǎo)致病理性瘢痕形成[25]。

成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)是M2分泌的細(xì)胞因子之一，酸性成纖維細(xì)胞生長因子(acidic GFG，aFGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic FGF，bFGF)和成纖維細(xì)胞生長因子-7(FGF-7)參與調(diào)控創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成過程[26]。aFGF抑制瘢痕增殖期的成纖維細(xì)胞增殖，而bFGF、FGF-7促進(jìn)增殖期的成纖維細(xì)胞增殖[27]。M2主要分泌bFGF，提示M2可通過分泌bFGF發(fā)揮促進(jìn)愈合、促進(jìn)瘢痕增殖期的雙刃劍作用。MFG-E8(Milk fat globule-epidermal growth factor-8)基因在組織愈合中發(fā)揮對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用，促使M1向M2轉(zhuǎn)化，促進(jìn)bFGF(FGF-2)生成，進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[28]。研究顯示，M2a高表達(dá)fgf2基因，通過纖維母細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)信號通路促進(jìn)血管形成。M2c通過胎盤生長因子信號通路促進(jìn)血管生成[29]。