吸入性肺損傷動(dòng)物模型構(gòu)建研究進(jìn)展

王東梅，穆云婧，周 茜，石 沛，霍煜廷，王瑩瑩*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

近年來，霧霾的高頻率大范圍出現(xiàn)導(dǎo)致肺部疾病發(fā)生率呈直線上升趨勢。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明:長期暴露于高濃度細(xì)顆粒物PM 2.5污染的空氣中，會增加肺部疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，造成呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率急劇上升[1]。因此，防治霧霾導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病是醫(yī)務(wù)工作者亟待解決的重大問題。

肺臟是霧霾天氣下首要損害器官，可能與下列機(jī)制有關(guān)：①霧霾刺激下使肺組織中免疫細(xì)胞激活，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，抑制有絲分裂，使細(xì)胞功能損傷或喪失[2]；②霧霾中的有毒成分使細(xì)胞死亡[3]，引起局部炎癥和氧化損傷，甚至造成肺纖維化等[4]；③長期暴露于霧霾天氣下，導(dǎo)致免疫球蛋白IgE表達(dá)顯著升高[5]，從而促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、慢性支氣管炎等疾病的發(fā)生[6]。

針對上述機(jī)理，將霧霾吸入性肺損傷歸納為物理性、化學(xué)性、生物性及顆粒性肺損傷；并設(shè)計(jì)出各種動(dòng)物模型。本文就這些霧霾吸入性肺損傷動(dòng)物模型構(gòu)建作一綜述。

1 霧霾概念

霧是自然天氣的一種，主要成分是水，是空氣中的水汽達(dá)到飽和時(shí)與微小顆粒結(jié)合而形成，霾(particle mass，PM)是人類活動(dòng)向大氣排放的微小顆粒物分散到大氣中的固體氣溶膠[7]。霧霾成分極其復(fù)雜，包括氣體、液體和固體成分，如二氧化硫(SO2)、霧滴和汽車尾氣等[8]。PM 2.5是指粒徑小于2.5 μm的微小顆粒，可直接進(jìn)入下呼吸道并在肺葉貯存[9]。

2 霧霾吸入性肺損傷的動(dòng)物模型構(gòu)建

2.1 物理性肺損傷模型的構(gòu)建

二氧化硅(silicon dioxide,SiO2)又稱矽塵，是導(dǎo)致霧霾天氣及矽肺病主要原因之一[10]。研究者通常用此構(gòu)建無機(jī)顆粒物導(dǎo)致的肺損傷模型。在構(gòu)建模型時(shí)研究者在劑量的選擇會有所不同。Muhle在1989[11]、1995[12]連續(xù)兩年為大鼠吸入1 mg/m3SiO2，100只大鼠中有18只大鼠發(fā)生了良、惡性腫瘤。可見二氧化硅的危害性。Deb等[13]將兩組Wistar雄性大鼠在28 d的時(shí)間里，分別吸入濃度為(150 mg/m3、300 mg/m3)的二氧化硅氣霧劑，與對照組相比，模型組生化指標(biāo)明顯提高且呈濃度升高依賴性。分析原因是在構(gòu)建急性肺損傷時(shí)需要選用大劑量二氧化硅快速建立模型，而構(gòu)建慢性肺損傷時(shí)則可以選用長時(shí)間、小劑量二氧化硅造模。有研究同時(shí)用微米與納米二氧化硅造模并進(jìn)行對比，注入濃度相同的納米、微米二氧化硅混懸液，10周后處死大鼠進(jìn)行同劑量肺系數(shù)(lung index, LI)對比，納米組大于微米組，肺組織切片顯示，納米組大鼠有大量炎細(xì)胞浸潤，而微米組大鼠有典型的矽肺表現(xiàn)[14]。在構(gòu)建模型時(shí)納米二氧化硅的肺損傷效果更加明顯，而微米二氧化硅更適合于硅肺病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯?。在灌注方式上李曙芳等[15]選用非暴露氣管法，將大鼠一次性注入1 mL二氧化硅矽塵混懸液(50 mg/mL)，模型組肺組織形成廣泛纖維化。有研究者將大鼠喉頭與胸骨之間切開約1 cm左右切口，沿大鼠軟骨間隙注入二氧化硅混懸液后縫合。無論是肉眼還是HE染色觀察，大鼠肺部各項(xiàng)指標(biāo)都嚴(yán)重受損，同樣研究者探索出濃度為50 mg/mL的二氧化硅1 mL是最佳劑量[16]。在謝英等[17]的研究中選用SD大鼠進(jìn)行二次氣管切開灌注法，在大鼠頸正中線切5～7 mm的刀口注入二氧化硅混懸液，一周后再次用同樣的方法造模。模型組表面灰白有磨砂感，對照組表面正常，染塵組大鼠各項(xiàng)炎性因子水平均高于對照組。非暴露法操作簡單,可重復(fù)給藥，適合需要長期給藥的動(dòng)物模型，但是難以確定粉塵是否進(jìn)入肺部，且造模時(shí)間長。而暴露法造模時(shí)間較短更直觀，但這種方法會降低動(dòng)物的成活率且較適用于手法嫻熟的研究者。

二氧化硅是霧霾天氣中嚴(yán)重的有害物質(zhì)，其造模的成功，有助于科研工作者研制出治病機(jī)理和找到更好的方法治療硅肺病。目前染矽造模方法很多，每種都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。研究者應(yīng)根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件結(jié)合自身實(shí)際情況去選擇合適的模型構(gòu)建方法。

2.2 化學(xué)性肺損傷模型的構(gòu)建

廢棄物、建筑行業(yè)的石油燃燒等產(chǎn)生酸性物質(zhì)而造成肺組織細(xì)胞凋亡、充血等現(xiàn)象，人體吸入這些有害物質(zhì)后會造成化學(xué)性肺損傷[18]。有研究顯示，在北京及華北地區(qū)霧霾頻發(fā)，重度污染時(shí)酸性物質(zhì)可高達(dá)20%[19]。在模擬酸吸入性肺損傷時(shí)，研究者經(jīng)常使用鹽酸進(jìn)行模型構(gòu)建。在Puig等[20]的研究中，選用SD大鼠氣管內(nèi)滴入鹽酸(1.2 μL/g, 0.1 mol/L， pH=1.4)并溶于300 μL無菌生理鹽水中，處死大鼠后整塊切除氣管和肺，并測其各項(xiàng)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建大鼠急性肺損傷模型。楊韶華等[21]對實(shí)驗(yàn)組小鼠氣管切開約5 mm切口，插入導(dǎo)管至小鼠門牙2.8 cm處，將小鼠置于右側(cè)臥位導(dǎo)入0.1 mol/L(1 μL/g)鹽酸，研究表明實(shí)驗(yàn)組小鼠的深吸氣量(inspiratory capacity)出現(xiàn)明顯降低，肺組織檢查功能明顯下降，表明造模成功。但在給小鼠進(jìn)行造模時(shí)，將小鼠氣管切開灌注酸性試劑，會使得小鼠的成活率降低。在郭磊等[22]的研究中，利用光纖電源引導(dǎo)，將插管插入小鼠的氣管中，使小鼠45°右側(cè)臥位，給予0.1 mol/L的pH=1.5的鹽酸(2.5 μL/g)推注到小鼠右肺葉，小鼠表現(xiàn)肺彈性激增，細(xì)胞免疫炎癥因子含量均顯著升高。這種方法降低了小鼠的死亡率、減少了小鼠因切口感染損傷評估的干擾，并且可以最大限度的提高灌流鹽酸的濃度和體積。在趙彩紅等[23]的研究中，自制致傷室建立鹽酸吸入性肺損傷大鼠模型。致傷室為不完全封閉的透明玻璃箱，配有溫度計(jì)、霧化器及采集氣體樣本的物品。將酸霧送到致傷室，嚴(yán)格控制變量，根據(jù)不同濃度氯化物大鼠的表現(xiàn)，最終確定當(dāng)氯化物濃度為200 mg/L，時(shí)間為20 min時(shí)為最佳造模條件。該研究彌補(bǔ)了缺乏鹽酸吸入性肺損傷動(dòng)物模型的空白。

霧霾形成的關(guān)鍵是產(chǎn)生酸性化學(xué)物質(zhì)[8]，有害的化學(xué)成分在霧霾形成中造成不利影響，嚴(yán)重危害人體健康，導(dǎo)致呼吸道等疾病。模型構(gòu)建成功有助于探究其機(jī)理及藥物的選擇。

2.3 生物性肺損傷模型的構(gòu)建

霧霾天氣時(shí)細(xì)菌顯著增多，如肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等，這些細(xì)菌侵入機(jī)體時(shí)，呼吸道疾病患病率大大增加[24]。研究者在構(gòu)建生物性肺損傷模型時(shí)，在選擇注入部位、方式及選用的菌群會有所不同，在Maura 等[25]的研究中，在小鼠鼻孔滴入10 μL銅綠假單胞菌的細(xì)菌濁液后將小鼠垂直擺放以保證細(xì)菌被徹底吸入。病理檢查顯示小鼠的肺組織、炎性因子都與對照組有顯著差異，小鼠出現(xiàn)明顯的肺炎表現(xiàn)。劉洋等[26]分別在小鼠鼻腔部和尾靜脈注射克雷伯桿菌(3×109CFU/mL, 100 μL/10 g)，結(jié)果顯示小鼠尾靜脈感染后6 h出現(xiàn)呼吸急促、立毛、蜷縮等現(xiàn)象，經(jīng)鼻腔滴注的小鼠在24 h后開始出現(xiàn)打噴嚏等癥狀，且尾靜脈小鼠的炎性因子均高于鼻腔滴注組，說明經(jīng)靜脈細(xì)菌感染較鼻腔感染速度快，更加嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)證明，尾靜脈感染細(xì)菌更適合克雷伯桿菌的模型構(gòu)建，而鼻腔灌注法更適合在不同時(shí)間點(diǎn)構(gòu)建程度不同的肺損傷。有研究通過克雷伯桿菌對急性肺損傷大鼠造模中，用比濁儀將菌液濃度調(diào)制(1.5×108CFU/mL)，實(shí)驗(yàn)組將克雷伯桿菌通過長為3.0 cm的細(xì)管注入大鼠口腔，隨機(jī)抽取兩只大鼠進(jìn)行指標(biāo)觀察，模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重肺水腫，炎性因子顯著增高[27]。

霧霾天氣下細(xì)菌的相對百分比可高達(dá)80%以上[28]，細(xì)菌性肺炎是醫(yī)院就診最常見疾病[29]，威脅人類的健康。生物性肺損傷的造模成功有助于研究者通過模型的觀察，更好的探究細(xì)菌毒力功能及抗菌藥物、抗毒力藥物的研究。

2.4 顆粒性肺損傷模型的構(gòu)建

顆粒性肺損傷霧霾模型構(gòu)建是研究者常使用的造模方法。一般需要在空氣質(zhì)量指數(shù)(air quality index, AQI)達(dá)到一定程度時(shí)進(jìn)行顆粒物采集，期間需要記錄當(dāng)天的AQI值、采集開始、結(jié)束時(shí)間，采樣的流量等，進(jìn)行分離震蕩、提純保存在冰箱里備用[30]。Keiki等[31]通過采集霧霾顆粒，取200 μg的PM 2.5顆粒溶于2.5 μL的生理鹽水，鼻腔注射致敏小鼠連續(xù)五天，觀察支氣管肺泡灌洗液的影響，模型組與對照組的統(tǒng)計(jì)有顯著差異，模型組小鼠出現(xiàn)呼吸急促、蜷縮等氣道過敏表現(xiàn)。通過采集器收集霧霾顆粒并滴注于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的模型構(gòu)建方法比較常見。同時(shí)，也有研究通過人工制造霧霾環(huán)境，讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物直接吸入氣體。王黎明等[32]利用有機(jī)玻璃制作一個(gè)封閉式試驗(yàn)裝置，燃燒模擬霾的顆粒物，在缸底裝置風(fēng)扇以保證氣體的流動(dòng)。試驗(yàn)結(jié)果表明該裝置可以成功產(chǎn)生指定霧霾環(huán)境。也有研究在與霧霾形成條件相同的氣候室中，利用粉碎機(jī)將鹽酸、煤灰等粉碎成直徑2.5 μm級別，將冷風(fēng)機(jī)吹入氣候室，形成霧霾天氣現(xiàn)象，經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，已粉碎的顆粒直徑在2.5 μm以下的體積比例高達(dá)50%～70%，全部粒徑體積均小于10 μm,滿足霧霾條件，表明氣流粉碎系統(tǒng)可以在人工氣候室模擬霧霾的可行性[33]。

模型的成功有利于研究者接下來的科研探索。但兩種方法都有其利弊，通過采樣器采集滴注法給動(dòng)物進(jìn)行造模是動(dòng)物被動(dòng)灌入混懸液，可能會與正常吸入霧霾有所差異。而自制霧霾模擬裝置雖然可以使動(dòng)物自行呼入有害物質(zhì)，但試驗(yàn)裝置內(nèi)的氣體會與真正的霧霾有所差異。

3 小結(jié)

霧霾給人類帶來經(jīng)濟(jì)和健康問題且呈逐年上升趨勢[34]，霧霾的治理和霧霾引起的疾病是當(dāng)下環(huán)境工作者和醫(yī)學(xué)工作者的科研熱點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建是研究疾病機(jī)制及藥物研制的基礎(chǔ)。國內(nèi)外研究者針對霧霾吸入導(dǎo)致的這四種類型肺損傷造模方法，可以較好地模擬霧霾引起的肺損傷，以便接下來探究霧霾導(dǎo)致肺損傷的機(jī)理和藥物的治療。

二氧化硅導(dǎo)致的霧霾吸入性肺損傷會造成TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)、p-Smad2/3表達(dá)量顯著提高，從而導(dǎo)致一系列的肺部炎癥表現(xiàn)[35]。研究者利用二氧化硅顆粒，選用不同的劑量、灌入方法模擬物理吸入性肺損傷，該方法適用于研究塵肺病的實(shí)驗(yàn)研究。酸吸入性肺損傷后會導(dǎo)致會造成肺組織細(xì)胞凋亡，血漿TNF-α等炎性因子顯著升高，嚴(yán)重?fù)p害呼吸道[36],上述研究中選用鼻腔滴入、氣管切開、自制氣霧室等方法灌入不同濃度的鹽酸試劑，模擬急、慢性鹽酸吸入性肺損傷，鹽酸價(jià)格便宜，易獲得，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺損傷具有較重要的意義，但鹽酸具有強(qiáng)腐蝕性，研究者在使用時(shí)需要格外小心。細(xì)菌誘導(dǎo)的霧霾吸入性肺損傷使肺組織中的氧自由基活性顯著提高，從而引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的改變最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[37]。上述方法中實(shí)驗(yàn)者選用不同的菌群模擬細(xì)菌導(dǎo)致的生物性肺損傷，更適合于研究霧霾天氣下引起的肺炎、氣管炎等慢性疾病的模型。PM 2.5中的有害成分通過影響Fe3+的運(yùn)輸[38]，改變受體表達(dá)和細(xì)胞的抗菌作用[39]，從而導(dǎo)致肺部疾病的發(fā)生，顆粒性肺損傷可以較好地模擬霧霾天氣下肺部損傷的危害，但這種方法需要花費(fèi)大量時(shí)間，實(shí)驗(yàn)者應(yīng)根據(jù)自己的需要及實(shí)驗(yàn)條件權(quán)衡適合自己的方法。

這些模型都是吸入性肺損傷模型，可以在不同的角度與霧霾造成的肺損傷相關(guān)，以上的模型構(gòu)建方法都不能完全復(fù)制出霧霾吸入性肺損傷的免疫機(jī)制病理，都會和現(xiàn)實(shí)霧霾天氣的有害物質(zhì)含量、劑量或吸入方式有差異，希望接下來的實(shí)驗(yàn)研究會彌補(bǔ)這一方面的空白，以便更好的進(jìn)行科研研究，解決霧霾吸入性肺損傷這一難題，以保護(hù)人類的健康。