豬精液冷凍保存技術(shù)的影響因素及損傷機理

谷圣臣，張兆博，鄭麗云，周琳琳，王 雙，魏國生，李井春

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

豬精液冷凍保存是指通過干冰、液氮、液氦等制冷劑的降溫作用，將采集到的新鮮精液進行離心、稀釋、降溫平衡、分裝等工序，冷凍保存于超低溫環(huán)境中，當(dāng)溫度升高后，又可恢復(fù)其生理活性，使其具有受精功能的一個過程[1]。豬精液的冷凍保存不僅提高了優(yōu)良種公豬的利用率，而且對于我國的一些優(yōu)秀地方品種遺傳資源的保護具有重大意義[2]。但由于人們對豬精液的冷凍- 解凍機理和損傷機理等尚未完全掌握，在一定程度上限制了豬精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。

1 豬精液冷凍保存的影響因素

1.1 稀釋液

精子細(xì)胞在冷凍的過程中，僅僅依靠精凊的自身保護作用是不夠的，還需要向精液中添加稀釋液，從而能更好地保護精子，減少低溫打擊對精子活率、頂體完整性等所造成的不利影響。稀釋液的主要成分有：糖類、蛋白質(zhì)及脂蛋白、冷凍保護劑、抗氧化劑、緩沖液、其他添加劑等。1）糖類包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖等，經(jīng)研究表明，海藻糖能降低精子外周滲透壓，減少精子向外流失水分，從而提高精液冷凍保存的效果[3]。2）冷凍保護劑包括甘油、卵黃、乙二醇、丙二醇等，根據(jù)其能否穿過精子質(zhì)膜進入精子細(xì)胞，冷凍保護劑又可分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑，滲透性保護劑主要有甘油、卵黃、乙二醇、丙二醇等，他們的分子量小，能更好地結(jié)合水分子，使溶液的黏度增加，減少冰晶對精子所產(chǎn)生的損傷[4]。甘油對精子既有保護作用，同時對精子質(zhì)膜和頂體又有損害作用，影響精子活率，經(jīng)研究表明，稀釋液中甘油含量為2% ～4%時, 精子所受到的損傷最小，精子冷凍后成活率最高[5]。非滲透性保護劑主要是指糖類和醇酮類，主要有葡萄糖、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇等，研究表明，糖類與甘油的結(jié)合使用能更加有效地保護精子，降低精子的死亡率[6]。非滲透性保護劑能溶于水，但不能進入精子細(xì)胞，從而有效提高精子外周滲透壓，當(dāng)溫度降低時，精子外周的高滲溶液會吸收精子細(xì)胞內(nèi)的水分，減少冰晶對精子產(chǎn)生的損害。3）一般來說，精子在代謝過程中產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）處于一個動態(tài)平衡，然而當(dāng)溫度大幅變化時，ROS 的產(chǎn)生量大于分解量，就會對精子質(zhì)膜產(chǎn)生損傷，在稀釋液中添加抗氧化劑可以降低這種損傷，抗氧化劑主要包括：維生素C、維生素E 等維生素類，以及超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等酶類[7]。4）緩沖溶液和添加劑主要包括檸檬酸、磷酸鹽、抗生素等。

1.2 稀釋方法

最常用到的稀釋方法包括一次稀釋法和二次稀釋法。一次稀釋法是根據(jù)精子的活率和密度，直接將精液和含有甘油的稀釋液等溫混合后分裝并冷凍的方法，這種方法沒有考慮到甘油和冷休克對精子所造成的損傷，一般不采用。二次稀釋法的優(yōu)點在于，考慮到了精子在降溫過程中會產(chǎn)生冷休克，降低精子成活率，給精子一個緩沖的平衡時間，可以很好地減輕這種損傷，以15 ℃和5 ℃為界點。首先，將室溫環(huán)境中的精液和不含甘油的稀釋液Ⅰ混合均勻，1 h 之內(nèi)使溫度降至15 ℃并保持3 ～4 h ；其次，再用1 h 的時間將溫度降至5 ℃并保持2 h ；最后將精液與含甘油的稀釋液Ⅱ等溫混合，分裝并置于液氮中冷凍[8]。

1.3 冷凍溫度和速度

當(dāng)采用不同的冷源時，其冷凍溫度也不一樣，精子最佳入液氮溫度為-120 ～-20 ℃，研究表明，入液氮溫度越低，精子的成活率越高[9]。冷凍速度在精液的冷凍過程中也發(fā)揮著重要作用，在冷凍過程中，應(yīng)使精子盡可能快地通過危險溫區(qū)（-60 ～0 ℃），因為此時精液正處于由液態(tài)向玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變的過渡時期，此時精子細(xì)胞內(nèi)外會產(chǎn)生大量冰晶，這些冰晶能刺破精子質(zhì)膜，從而對精子產(chǎn)生損害。

1.4 冷凍劑型

豬精液最常用的冷凍保存形式有：顆粒、0.25 mL 細(xì)管、0.5 mL細(xì)管、5 mL 細(xì)管、塑料（鋁箔）袋等。不同的冷凍保存技術(shù)具有不同的特點：顆粒法雖表面積容量大，易于冷凍保存，但其標(biāo)識困難，難以辨認(rèn)，不同顆粒之間容易交叉感染，這些缺點極大地限制了顆粒法的應(yīng)用。0.25 mL 細(xì)管和0.5 mL 細(xì)管的表面積容量也很大，冷凍和解凍速度快，適合超低溫冷凍保存。但單管精液的容量小，且每一次輸精需要大量的精液，從而加大了授精人員的工作負(fù)擔(dān)。5 mL 細(xì)管雖含有1 頭份的精液量，但其表面積容量小，在冷凍和解凍的過程中，細(xì)管內(nèi)部的精子受冷或受熱不均勻，精子存活率較低。塑料袋法表面積容量大，且含有1 頭份的精液量，可以說是其他冷凍方式優(yōu)點的集合體，但由于塑料袋表面積大，難以在液氮中貯存而遲遲沒有推廣開來[10]。

1.5 解凍溫度、速度、方法

解凍和冷凍一樣， 只有使精子盡可能快地穿過危險溫區(qū)（-60 ～0 ℃），才能提高精子的解凍成活率。解凍溫度主要有0 ～5 ℃、30 ～40 ℃、50 ～70 ℃這3 種，細(xì)管型凍精最常用到的解凍方法是將細(xì)管置于35 ～40 ℃的溫水中，待凍精融解到一半時取出備用。研究證明，0.25 mL 細(xì)管所儲存的凍精在37 ℃溫水中保持30 s，其解凍效果最好，精子成活率和頂體完整性最高[11]。而顆粒型凍精的解凍方法又分為干解凍法和濕解凍法，其中干解凍法是先將顆粒凍精放置于50 ～60 ℃水浴的滅菌容器中，然后放入解凍液，使其解凍。濕解凍法是先將解凍液放置于50 ～60 ℃的水浴的滅菌容器中，然后放入顆粒凍精，對比這兩種解凍方法可知，除解凍液和顆粒凍精放置的先后順序不同以外 ，其他操作過程并無差異[12]。

2 豬精液冷凍的損傷機理

2.1 物理損傷

在冷凍- 解凍的過程中，精液要經(jīng)歷由液態(tài)向玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變的過渡階段，此時，稀釋液中的水分和細(xì)胞內(nèi)液兩者形成的冰晶會刺傷精子質(zhì)膜以及DNA 等內(nèi)部結(jié)構(gòu)，致使細(xì)胞器外露, 導(dǎo)致精子變性失活。

2.2 化學(xué)損傷

當(dāng)溫度降低，精子細(xì)胞外液會先形成冰晶，從而使細(xì)胞外液的滲透壓升高，由于精子細(xì)胞內(nèi)滲透壓低，水由細(xì)胞內(nèi)部的低滲溶液向細(xì)胞外的高滲溶液轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致精子細(xì)胞失水皺縮、蛋白質(zhì)變性、質(zhì)膜損壞，最終脫水死亡[13]。

2.3 自身氧化損傷

當(dāng)溫度大幅變化時，精子細(xì)胞會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，致使ROS動態(tài)平衡被打破，ROS 大量積聚，從而產(chǎn)生大量的脂類過氧化物，導(dǎo)致精子質(zhì)膜破損，DNA 鏈斷裂，核染色質(zhì)損傷，精子呼吸被抑制, 蛋白質(zhì)氧化損傷，精子畸形，精子成活率大大下降[14]。

3 結(jié)語

豬精液冷凍保存技術(shù)的出現(xiàn)具有跨時代的意義，這使得優(yōu)良種公豬的精液可以在世界范圍內(nèi)傳播，不再受時間和地域間的限制，同時節(jié)省接近90% 的種公豬，極大地降低了飼養(yǎng)成本，推動了種豬遺傳育種和品種改良進程，為世界生豬產(chǎn)業(yè)提供更加優(yōu)秀的種源。但目前豬精液冷凍保存技術(shù)尚未完全成熟，未來應(yīng)著重于稀釋液的開發(fā)，以及稀釋液對精子毒副作用的研究。同時，應(yīng)在分子層面上研究精子的損傷機理，找出各影響因素的最佳解決方案，最終提高豬精子冷凍后成活率和受精率，進一步推動養(yǎng)豬事業(yè)的蓬勃發(fā)展。