淺談目前豬非洲豬瘟病毒的常用診斷方法

尹訓(xùn)強(qiáng)

（廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司，廣東 云浮 527400）

距我國首次報道非洲豬瘟病毒（ASFV）感染病例已經(jīng)一周年了，一年內(nèi)該病毒幾乎肆虐了國土全境，隨之造成了生豬存欄量銳減、豬肉價格發(fā)生猛漲的情況。近期候選疫苗出現(xiàn)、非洲豬瘟弱毒疫苗專利申請成功，據(jù)報道中國有關(guān)權(quán)威部門公布的首例非洲豬瘟流行毒株（SY18）為親本構(gòu)建的多基因家族（MGF）基因和CD2v 基因缺失的非洲豬瘟病毒基因缺失疫苗候選株[1]和中國流行非洲豬瘟毒株P(guān)ig/CN/HLJ/2018 缺失的MGF360-505R 缺失和CD2v 與MGF360-505R 聯(lián)合缺失的基因缺失病毒[2]，均顯示出可作為安全和有效的防控中國非洲豬瘟的疫苗的卓越潛能，具有極大的社會價值和國際意義。僅靠撲殺等成本巨大的非洲豬瘟凈化手段，不符合我國生豬飼養(yǎng)量巨大的國情，借鑒已有的多種病毒病共存的防控經(jīng)驗，研制出有效、安全的防控非洲豬瘟疫苗是目前最為有效和經(jīng)濟(jì)的方法。隨著非洲豬瘟流行病學(xué)、相關(guān)致病機(jī)制、防治疫苗研發(fā)、檢測手段等相關(guān)領(lǐng)域研究工作的加快，以及未來中國生豬養(yǎng)殖常態(tài)化免疫非洲豬瘟疫苗的極大可能，針對非洲豬瘟病毒的臨床診斷技術(shù)和快速診斷檢測技術(shù)產(chǎn)品的使用，始終會伴隨著各個防控非洲豬瘟和生豬養(yǎng)殖的各個環(huán)節(jié)。

1 臨床早期表現(xiàn)及診斷

基層獸醫(yī)的專業(yè)性水平?jīng)Q定著臨床早期診斷ASFV 的成敗，獸醫(yī)從業(yè)者面對該病更要在診斷環(huán)節(jié)中加強(qiáng)學(xué)習(xí)和總結(jié)，進(jìn)而不斷提高對該病的臨床診斷技術(shù)。

1.1 三種毒力類型ASFV 在臨床上的不同表現(xiàn)[3]

不同類型的ASFV 的主要臨床表現(xiàn)和剖檢病變的指標(biāo)包括以下方面：精神狀態(tài)、體征變化、凝血不良的現(xiàn)象、皮膚、淋巴結(jié)、心、肝、脾、肺、腎、膽囊、扁桃體、繁殖性能變化等。

強(qiáng)毒株可引起最急性型（感染后1 ～4 d 死亡）和急性型（感染后3 ～8 d 死亡）臨床表現(xiàn)。發(fā)病豬體溫可達(dá)41 ～42 ℃，嘔吐、血便、食欲廢絕、精神沉郁、呼吸困難，皮膚充血變紅或變藍(lán)色，豬只有時無征兆發(fā)生猝死，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%。

中等毒力毒株可引起感染20 d后死亡的亞急性型表現(xiàn)，死亡率略低，打針流血不止。主要癥狀是比急性型更為強(qiáng)烈的出血和水腫，死亡率為30% ～70%。耐過豬約3 ～4周后康復(fù)后成為帶毒豬。

強(qiáng)毒力、中等毒力毒株是以發(fā)熱和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織出血為特征[4]，均可使妊娠母豬流產(chǎn)，胎兒全身水腫，胎盤、皮膚、心肌或肝臟可見淤血點(diǎn)。

低毒力毒株引起慢性型的特征是病豬無出血表現(xiàn)，耳部、腹部和大腿內(nèi)側(cè)等部位皮膚可見壞死、局部紅斑或凸起，康復(fù)后成為病毒攜帶者。

1.2 病理變化

最急性型發(fā)病豬急性死亡，其內(nèi)臟組織器官的肉眼病變不明顯。

急性型病豬，脾充血性腫大約3 ～6 倍，邊緣腫脹、質(zhì)脆、外觀黑紫色；胃、肝和腎等部位的淋巴結(jié)出血、腫大，質(zhì)地變脆；腎臟皮質(zhì)和腎盂通常出現(xiàn)瘀血點(diǎn)。病豬因肺水腫嚴(yán)重而死亡；胃底部淤血，膽囊充盈。其他非典型病理變化還包括膀胱、心內(nèi)膜、心外膜和胸膜有出血點(diǎn)。發(fā)生腹瀉或血便的病豬可見出血性腸炎。

亞急性型豬只呈現(xiàn)腹水、心包積液、膽囊和膽管壁的特征性水腫以及腎周邊水腫。脾臟起初表現(xiàn)為出血性腫大，逐漸轉(zhuǎn)歸；淋巴結(jié)呈現(xiàn)出血、水腫和易碎，呈現(xiàn)為深紅色血腫，主要是在胃和腎的淋巴結(jié)，以及頜下腺、咽后、縱膈、腸系膜和腹股溝淋巴結(jié)。腎臟（皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂）出血比急性型更嚴(yán)重和廣泛。

慢性非洲豬瘟的病變特點(diǎn)表現(xiàn)為肺部局部肉芽腫，形成結(jié)節(jié)或肺臟肉樣實(shí)變、纖維素性胸膜炎、干酪樣肺炎和淋巴網(wǎng)狀組織增生；也常見纖維素性心包炎和壞死性皮膚病變；扁桃體和舌上可見壞死。

2 實(shí)驗室診斷方法

2.1 病原學(xué)診斷

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分為普通PCR 和實(shí)時熒光定量PCR 兩種。目前學(xué)術(shù)界研究的PCR 引物一般都是以靶向病毒基因組高度保守區(qū)域P72（P73）、P54 等蛋白基因[5-7] 設(shè)計，具有較高特異性和敏感性，適合各類ASFV 毒株的檢測。

世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦采用PCR 和實(shí)時熒光定量PCR方法，可以直接從采樣組織和體液中檢測病毒，具有良好的特異性[8]。相對來講，直接免疫熒光試驗主要用于檢測實(shí)質(zhì)臟器（脾臟、肺臟、淋巴結(jié)和腎臟）等組織觸片或冷凍切片中的病毒抗原，該方法快速、經(jīng)濟(jì)和敏感性高，但對于非洲豬瘟的亞急性或慢性病例，若組織中已形成了抗原- 抗體復(fù)合物，那么該方法的敏感性會下降到40% ；血細(xì)胞吸附試驗的原理是，紅細(xì)胞能吸附在體外培養(yǎng)的感染ASFV 的巨噬細(xì)胞膜表面，因此，將病料組織感染巨噬細(xì)胞后，紅細(xì)胞如果在巨噬細(xì)胞周圍形成典型的玫瑰花環(huán)，則證明該病料組織中含有ASFV。該方法特異性和敏感性均較高，但有些非洲豬瘟病毒毒株能迅速誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，而不出現(xiàn)血細(xì)胞吸附現(xiàn)象。

此外，也有人采用非結(jié)構(gòu)蛋白DNA 聚合酶G1211R 基因的實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）方法，用于大量樣品的快速檢測。研發(fā)ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒，可以避免由于操作環(huán)境、試劑不同和人為操作水平參差不齊等原因而影響該方法對ASFV 的檢測效果。

2.2 血清學(xué)診斷

檢測抗體可用于ASFV 感染豬的診斷，目前常用的有間接免疫熒光試驗（IFA）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等，并且OIE 將ELISA 作為診斷ASFV 的首選血清型方法。最急性和急性病例的豬死亡率高，通常血清抗體轉(zhuǎn)陽前即會死亡。亞急性病豬耐過或康復(fù)后可產(chǎn)生高水平的ASFV 特異性抗體。一般病毒感染后4 d 可產(chǎn)生IgM 抗體，感染后6 ～8 d 產(chǎn)生IgG 抗體?？贵w與ASFV 可同時存在于感染豬血液，大約持續(xù)6 個月，有時病毒可存在數(shù)年。

ELISA 檢測法是一種靈敏的、廉價的方法，可大批量檢測血清。但該法不足之處就是常有假陰性或假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，這主要是因血清的保存不當(dāng)及缺少特異性抗體而引起的[9]。

3 討論

3.1 對ASF 的臨床診斷必須及時和準(zhǔn)確

“早、快、嚴(yán)、小” 是傳染病處理原則，要求基層防疫過程中，對病原體要早排查、早發(fā)現(xiàn)、早上報、早診斷！只有及時診斷出來結(jié)果，才會避免大面積污染環(huán)境，然后立即采樣、上報、必須在國家指定的實(shí)驗室檢測疑似病豬。

與ASFV 感染相關(guān)的臨床特征具有高度的可變性，這取決于多種因素：病毒致病力、豬的品種、暴露途徑、感染劑量和該地區(qū)的非洲豬瘟流行狀況。因為國內(nèi)研究條件要求的嚴(yán)格性、基層豬場總結(jié)臨床癥狀的專業(yè)性缺乏等原因，造成很少報道中國豬場感染病毒及病毒致病能力大小的文章，從而對本國毒株及其致病性能的研究缺乏臨床詳細(xì)的資料。

目前已發(fā)現(xiàn)，在疫病流行區(qū)（在中、強(qiáng)毒株傳播的同時）存在低毒力的毒株，非洲豬瘟潛伏期可達(dá)4 ～19 d，如此較長的潛伏期可以帶來很大的影響，對于國際上廣泛采用的早期定點(diǎn)精準(zhǔn)清除病豬措施來講，直接決定了其成功與否和是否能干凈處理。也是追溯感染最初時間的重要依據(jù)。

病理剖檢一般不建議進(jìn)行，哪怕是疑似。因為豬場在解剖過程中，出現(xiàn)任何不嚴(yán)密的操作和處理措施，很容易造成ASFV 的散播，進(jìn)而加重了生物安全防控工作。

ASFV 對于豬瘟、豬丹毒、豬繁殖與呼吸綜合征、豬皮炎腎病綜合征、中毒等病的鑒別診斷也同樣重要，驚恐之下，沒有診斷經(jīng)驗的獸醫(yī)往往誤診，造成的眾多無辜病豬被人為地?fù)錃ⅲ∫柚餍胁W(xué)特征進(jìn)行排除，如是否使用餐廚廢棄物飼喂豬、與售豬商販接觸、引入了來自疫區(qū)的感染豬、接觸了來自疫區(qū)的相關(guān)人員及豬肉制品等。在非洲豬瘟和其他病沒有出現(xiàn)明顯區(qū)別的臨床癥狀之前，最終還是要以權(quán)威實(shí)驗室的確診結(jié)果為主。

3.2 實(shí)驗室診斷方法是最有效的手段

實(shí)驗室診斷方法是目前對于研究非洲豬瘟病毒相關(guān)生化指標(biāo)數(shù)據(jù)的最有效的手段。

目前非洲豬瘟病毒格魯吉亞2007/1 毒株對家豬傳播的動力學(xué)機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，通過病毒滴定法和實(shí)時定量PCR(qPCR) 法檢測ASF病毒，利用血清學(xué)試驗測定ASF 病毒特異性抗體，試驗結(jié)果顯示，接種感染豬第3 天可在其血液中分離到有傳染性的ASF 病毒，而通過直接接觸和間接接觸進(jìn)行感染的豬分別在暴露后第10 天和第13 天方可從血液中分離到有傳染性的ASF 病毒，ASF 臨床癥狀發(fā)生時，ASF 病毒在血液中的滴度高于在鼻液和腸液中的，口液樣本中沒有分離到有傳染性的ASF 病毒而檢測到了其病毒的基因組[10]。

3.3 唾液檢測對前期檢測的研究價值

通過采集健康、 疑似、 患病豬只的唾液，對檢測ASFV 的敏感性、可靠性的研究，褒貶不一，還有待深入。有人研究得出，唾液及鼻腔黏液比血液中病毒檢出時間提早2~5 d，直腸黏液比血液中病毒檢出的時間雖然滯后，但其病毒載量更高，血液中病毒載量是唾液中病毒載量的1 萬倍，唾液比血液中病毒檢出時間提早3 d 以上。對檢測方法的靈敏度要求較高，唾液中含有DNA 酶和蛋白酶，可降解核酸的蛋白和DNA 的含量、不及時冷凍或運(yùn)輸中解凍，核酸均可被降解，因此唾液采集的方法的規(guī)范性很重要。相對而言，鼻腔黏液受到的干擾因素較小。精液中也存在著影響PCR 反應(yīng)的因素，需使用柱提法提取核酸。

另外，采集的病料的風(fēng)險因素的評估要求，唾液收集過程中，要避免病毒的擴(kuò)散。

3.4 實(shí)驗室診斷要求采樣和實(shí)驗室操作程序要準(zhǔn)確。

病毒感染潛伏期往往在組織和體液中是不一樣的，ASFV 往往先攻擊的是巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，此時扁桃體、唾液中可能會率先呈現(xiàn)出大量的病毒復(fù)制，所以前期采樣需要把重點(diǎn)放在這里。采樣往往因為這些環(huán)節(jié)微小的錯誤，就會影響有效檢出病毒量的結(jié)果。

核酸的快速的有效提取，很大程度上影響著檢測時間的長度。目前利用裂解酶免提取方法，大大節(jié)約了提取時間，可以在15 ～35 min內(nèi)完成檢測。

另外，提取核酸或者擴(kuò)增產(chǎn)物等過程中，操作不當(dāng)造成DNA 氣溶膠污染整個實(shí)驗室環(huán)境，往往使得檢測結(jié)果一直是陽性，這個時候就要借助一些生物試劑或者物理措施進(jìn)行反復(fù)處理，確保解除污染后再進(jìn)行正常操作。

3.5 ASFV 檢測試劑盒的行業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，仍需要進(jìn)行大量后期工作。

按照國家藥品監(jiān)督管理局第35號令《新生物制品審批辦法》的有關(guān)要求，對產(chǎn)品進(jìn)行長期的穩(wěn)定性考核，考察最敏感質(zhì)量指標(biāo)（最低檢出量和重復(fù)性），考核時間以產(chǎn)品的保質(zhì)期時間跨度為標(biāo)準(zhǔn)。在 “以科學(xué)研究為基礎(chǔ)、質(zhì)量監(jiān)控體系為保障” 的前提下，國家已經(jīng)公布了研發(fā)生產(chǎn)出的一批高質(zhì)量的ASFV熒光PCR 檢測試劑盒，實(shí)現(xiàn)了快速定量檢測。隨著越來越多檢測試劑盒的誕生，一定要建立試劑盒質(zhì)量要求和監(jiān)控體系，即針對合成的引物、探針、陰陽性對照品等部分，建立完善的質(zhì)量檢驗方法，保證試劑盒使用質(zhì)量，更好地服務(wù)獸醫(yī)診斷工作。