非洲豬瘟病毒分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李天芝，于新友

( 山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）為有囊膜的病毒，大小約175 ～215 nm，只有1個(gè)血清型。ASFV 為線狀雙鏈DNA病毒，基因組大小約170 ～190 kb，兩端為可變區(qū)， 中間為保守中心， 包 含150 個(gè)ORF， 可 編 碼150 ～200 種蛋白[1]，其中結(jié)構(gòu)蛋白28 種。根據(jù)P72 基因序列的差異，可分為24 種不同的基因型，我國(guó)流行的主要是基因Ⅱ型。病毒對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，尤其在濕冷環(huán)境可長(zhǎng)期存活。ASFV 宿主范圍較窄，僅能感染豬致其發(fā)生非洲豬瘟(African swine fever，ASF)，臨床表現(xiàn)主要為病豬高熱、厭食以及皮膚和內(nèi)臟器官?gòu)V泛出血[2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE) 和我國(guó)都高度重視ASF，分別把其作為必須通報(bào)的動(dòng)物疾病和一類動(dòng)物疫病[3-4]。

自2018 年8 月，ASF 在 我 國(guó)首次報(bào)道以來，迅速席卷全國(guó)[5]，不僅給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還造成重大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和政治影響[6]。目前尚無有效的商品化疫苗可用，也無有效治療藥物。其所引起的病變與豬瘟及細(xì)菌性敗血病等病變類似，因此，僅通過剖檢有時(shí)很難做出正確診斷，需借助實(shí)驗(yàn)室方法確診?？贵w檢測(cè)存在一定的缺陷：一是抗體產(chǎn)生的滯后性；二是抗體檢測(cè)不能判定現(xiàn)癥感染，故一般采取病原學(xué)方法進(jìn)行確診。由于方法本身局限性及國(guó)家相關(guān)政策等原因影響，傳統(tǒng)的病原分離，間接免疫熒光滿足不了臨床樣本檢測(cè)的需求，針對(duì)ASFV 核酸的分子生物檢測(cè)方法是最適宜該病檢測(cè)方法。該病防控主要依靠撲殺感染動(dòng)物、完善的生物安全措施，為滿足現(xiàn)場(chǎng)早期、快速、準(zhǔn)確排查ASF 疫情，阻止疫情在國(guó)內(nèi)的進(jìn)一步蔓延的需求，需借助先進(jìn)、科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。筆者綜述了ASFV 的6 種分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展情況，希望為ASF 的診斷及防控工作提供參考。

1 核酸探針

核酸探針主要是基于堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，修飾后寡核苷酸探針可與待檢核酸單鏈退火形成雙鏈，利用修飾物進(jìn)行抗原- 抗體反應(yīng)，以放大信號(hào)，達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)核酸的目的。張?chǎng)斡畹萚7]等根據(jù)GenBank 公布的22 株不同基因型的ASFV p72 基因比對(duì)和分析結(jié)果，選取保守基因序列，設(shè)計(jì)并合成一條寡核苷酸探針，探針5′端和3′端分別用生物素和烷巰基修飾，隨后將探針吸附到納米金顆粒上，制成金標(biāo)記探針。探針與PCR 擴(kuò)增的p72 基因保守序列進(jìn)行雜交后，加入包被有鏈霉素親和素的酶標(biāo)板進(jìn)行反應(yīng)，后用銀染法將信號(hào)放大。結(jié)果顯示，酶標(biāo)板中可見黑色沉淀，該法檢測(cè)的敏感度為10 fmol/L ASFV 核酸。

2 納米PCR

納米PCR 技術(shù)是將納米材料應(yīng)用PCR 所形成的一門新興技術(shù)，納米金粒子的應(yīng)用可提高酶的活性和穩(wěn)定性，提高反應(yīng)效率，改善非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，提高PCR 檢測(cè)特異性[8]，縮短PCR 反應(yīng)時(shí)間，使檢測(cè)更加具有準(zhǔn)確性、可靠性。崔尚金等[9]根據(jù)ASFV 基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立了檢測(cè)ASFV 的納米PCR 檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法特異性好，僅對(duì)ASFV 擴(kuò)增出特異的552 bp 目的基因，不與豬常見的多種病原如豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV2) 等核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，敏感性高，最低可檢測(cè)10 個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA 量，檢測(cè)敏感性是常規(guī)PCR 的1 000 倍。

3 多重PCR 法

多重PCR 是在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種方法，在同一反應(yīng)體系內(nèi)加入2 對(duì)及以上引物，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原的同時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)臨床疾病快速篩查。任梅滲等[10]參考PRV、CSFV、ASFV、PRRSV、副豬嗜血桿菌(HPS)、胸膜肺炎放線桿菌(APP) 以及多殺性巴氏桿菌(PM) 標(biāo)準(zhǔn)毒株序列，選擇各病毒和細(xì)菌的保守序列分別設(shè)計(jì)7 對(duì)特異性引物進(jìn)行多重PCR。各項(xiàng)優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)的退火溫度為51 ℃，各條引物濃度均為0.8 μmol/L 時(shí)，擴(kuò)增的目的條帶效果最佳，用敏感性試驗(yàn)檢測(cè)該反應(yīng)中各病毒的最小檢出量分別為：1.01×102copies / μ L ( P RV )、1.48×103copies /μ L ( C S F V )、1.07 ×104copies/ μL(ASFV)、9.73×103copies/μL(PRRSV)、1.82×103copies / μL ( HPS )、1.65×103copies / μL ( P M ) 和3.64×103copies/μL(APP)。 在 最 優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，能檢出對(duì)應(yīng)病原的多種血清型，陰性對(duì)照均無非特異性擴(kuò)增。冷依伊等[11]根據(jù)公布的病原保守基因序列，建立了同時(shí)檢測(cè)ASFV、水皰性口炎病毒(VSV)、豬 口 蹄 疫 病 毒(FMDV)、CSFV 和PRV 的多種PCR 檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法特異性好，對(duì)其他豬病原核酸無擴(kuò)增反應(yīng)條帶；該法敏感性好，對(duì)ASFV、PRV、FMDV、CSFV和VSV 的最低檢測(cè)限度分別為5.71 copies/μL、8.82×103copies/μL、4.32×102copies/μL、6.87×104copies/μL和4.93×104copies/μL，可用于臨床樣本的快速篩查。

4 熒光定量PCR

熒光定量PCR（qPCR）是將傳統(tǒng)PCR 與光譜技術(shù)結(jié)合發(fā)展的一種檢測(cè)技術(shù)，具有PCR 的所有優(yōu)點(diǎn)，可直接觀察擴(kuò)增結(jié)果，不需要后續(xù)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，減少了對(duì)環(huán)境氣溶膠污染的可能，避免了假陽(yáng)性結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)樣品的定性和定量檢測(cè)。據(jù)信號(hào)基團(tuán)的不同，qPCR 可以分為染料法和探針法兩種。曾少靈等[12]基于ASFV VP73 基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立了檢測(cè)ASFV 的熒光PCR 方法，并與OIE 推薦的方法進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，該方法敏感性高，檢測(cè)限度 為10 copies/μL， 同OIE 推 薦 方法敏感性一致，是常規(guī)PCR 的10倍，批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的CV值均不高于3.14%，具有良好的重復(fù)性。王建華等[13]建立了一種基于CP530R 基因檢測(cè)ASFV 的TaqMan-MGB 熒光PCR 方法， 結(jié)果顯示，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做模板，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.449x ＋38.10，相關(guān)系數(shù)為0.999，該方法不僅特異性好，對(duì)豬細(xì)小病毒(PPV) 、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬流感病毒(SIV)、PRRSV 和CSFV 等 核 酸 擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，最低可檢測(cè)61 個(gè)拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照分子，重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)不高于2.0%，方法重復(fù)性好。

隨后王建華等分別根據(jù)ASFV、CSFV 和 高 致 病 性PRRSV 的CP530R、5 ′ UTR 和NSP2 基 因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，建立了同時(shí)檢測(cè)這3 種病毒的多重?zé)晒釸TPCR 檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該方法特異性好， 不與PRV、PCV2、SIV、PPV 和PEDV 等核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)ASFV 的最低檢測(cè)限度為61 copies/μL，對(duì)CSFV 的最低檢測(cè)限度為11 copies/μL 和對(duì)高致病性PRRSV 核酸的最低檢測(cè)限度為41 copies/μL。組內(nèi)和組間變異系數(shù)均不高于2.5%，說明方法特異性好[14]。李霆等[15]根據(jù)ASFV E184L基因設(shè)計(jì)1 對(duì)引物及相應(yīng)探針，建立檢測(cè)ASFV 的TaqMan 熒光PCR方法。結(jié)果表明，該方法選擇的引物具有高度靈敏性和特異性，以標(biāo)準(zhǔn)品在重組質(zhì)粒為模板建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.992，對(duì)ASFV 核酸最低檢側(cè)限為1.5 拷貝， 且與PRV、PPV、PCV2等多種病原不存在交叉反應(yīng)。

5 微滴數(shù)字PCR

微滴數(shù)字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 是近年來新出現(xiàn)的新型PCR 方法，主要通過油包水的技術(shù)原理，將配置的PCR 反應(yīng)體系，分割成多個(gè)納米微滴，使得每個(gè)微滴不含或僅含少量待檢的核酸分子，每個(gè)微滴均為獨(dú)立擴(kuò)增系統(tǒng)[16]，依據(jù)泊松原理得出起始模板絕對(duì)含量[17]，不依賴Ct 值或內(nèi)參基因，即可最低定量檢測(cè)單拷貝的核酸分子，精確性更高。鄔旭龍等[18] 根 據(jù)ASFV 保 守 的K205R 基因，設(shè)計(jì)并合成1 對(duì)引物及Taq Man探針， 同時(shí)建立了檢測(cè)ASFV 的qPCR 和ddPCR 方法，并對(duì)這兩種方法從線性關(guān)系、敏感性、特異性和重復(fù)性等多方面進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法線性關(guān)系較好(R2≥0.998)， 但ddPCR 檢 測(cè) 敏 感性是qPCR 的10 倍，最低檢測(cè)限度為10 拷貝/ 反應(yīng)，而qPCR 的最低檢測(cè)限度為102拷貝/ 反應(yīng)，所建ddPCR 檢測(cè)ASFV 方法特異性好，與PRRSV、CSFV、JEV、PCV2、PRV、FMDV 等核酸無交叉反應(yīng)，重復(fù)性結(jié)果顯示，該法組內(nèi)變異系數(shù)在2.84% ～5.16% 之間、組間變異系數(shù)在3.68% ～5.14% 之間，說明方法重復(fù)性好。

6 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP) 方法由日本學(xué)者Notomi 等發(fā)明，是一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可用于臨床病原分子檢測(cè)，只需水浴鍋或恒溫箱等簡(jiǎn)單設(shè)備即能開展實(shí)驗(yàn)，通過在反應(yīng)體系中加入特殊物質(zhì)使得反應(yīng)結(jié)果肉眼可見，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優(yōu)點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層部門應(yīng)用。王華等[19]建立了檢測(cè)ASFV 的LAMP 檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該法可在62 ℃恒溫條件完成檢測(cè)反應(yīng)，所用時(shí)間為60 min， 對(duì)核酸檢測(cè)敏感性為10 copies/μL， 是 常 規(guī)PCR 的100倍，特異性好，不與PCV2、PPV、PRV 等豬常見病原核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。田純見等[20]根據(jù)ASFV 高度保守的非結(jié)構(gòu)DNA 聚合酶G1211R 基因設(shè)計(jì)引物，建立了ASFV 實(shí)時(shí)熒光LAMP 方法，并與熒光PCR 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，該法檢測(cè)靈敏度達(dá)21 pg，優(yōu)于熒光定量PCR 方法。 重復(fù)性試驗(yàn)LAMP 檢測(cè)批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%。該法特異性良好，與PCV2、PRV、CSDFV、PRRSV 及昆蟲核酸無交叉反應(yīng)。王學(xué)慶等[21]根據(jù)ASFV 保守基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立一種檢測(cè)ASFV 的LAMP 擴(kuò)增方法。該方法能在58 ℃恒溫條件下50 min 內(nèi)完成檢測(cè)反應(yīng)，敏感性實(shí)驗(yàn)表明，最低可檢出5 copies/μL的ASFV 核酸，該法與健康豬樣本、PRRSV 和PPV 核酸樣本不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。所建立的檢測(cè)方法反應(yīng)結(jié)束后，無需開蓋，可避免氣溶膠造成的污染。通過肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化判讀結(jié)果，若反應(yīng)液呈黃色，結(jié)果判為陽(yáng)性；若反應(yīng)液呈橙紅色，結(jié)果判為陰性。

7 重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerise amplification，RPA) 技術(shù)是的一種核酸檢測(cè)新技術(shù)[22]，它是由英國(guó)TwistDx Inc 公司于2006年成功研發(fā)。該技術(shù)主要利用3 種酶，重組酶、具有聚合鏈置換功能的DNA 聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白，代替了傳統(tǒng)PCR 的熱循環(huán)解鏈過程實(shí)現(xiàn)核酸快速大量擴(kuò)增[23]，25 ～42 ℃等溫條件下，30 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，不需要昂貴的儀器設(shè)備，產(chǎn)物的檢測(cè)可通過凝膠電泳、熒光檢測(cè)儀、側(cè)向流試紙條(LFD)、生物芯片等多種不同方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果讀取多元化、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。能滿足疫病快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。王建昌等[24]根據(jù)ASFV 保守性強(qiáng)的p72 基因序列，設(shè)計(jì)RPA 引物，建立了檢測(cè)ASFV 的RPA 檢測(cè)方法。 結(jié)果顯示，該方法可在38 ℃恒溫條件下30 min 內(nèi)完成檢測(cè)反應(yīng)，該方法檢測(cè)敏感性高，與OIE 推薦測(cè)熒光PCR 檢測(cè)方法一致，對(duì)含p72 基因重組質(zhì)粒的最低檢測(cè)限度為100 拷貝，特異性檢測(cè)表明該法特異性好，不與口蹄疫病毒(FMDV)、CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 等核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。哈登楚日亞等[25]設(shè)計(jì)了3 對(duì)針對(duì)ASFV p72 基因的引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件后，選取最佳的1 對(duì)引物和相應(yīng)探針，建立了ASFV 的RPA 檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法20 min 內(nèi)完成檢測(cè)反應(yīng)，全程反應(yīng)溫度維持39 ℃恒溫，特異性好，與CSFV、PCV2、PPV、PRV 等核酸均無交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)限度為10 拷貝。吳映彤等根據(jù)ASFV 多基因家族成員MGF360-12L 基因序列，設(shè)計(jì)引物， 建立了ASFV RPA 等溫檢測(cè)方法。結(jié)果表明，所建立的RPA 方法于35 ℃恒溫反應(yīng)30 min，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的穩(wěn)定擴(kuò)增，以含有MGF360-12L 基因的重組質(zhì)粒為模板，RPA 反應(yīng)的檢測(cè)限達(dá)到103個(gè)拷貝，同普通PCR 方法檢測(cè)限一致。此外，該法特異性好，僅對(duì)ASFV 核酸有陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和PCV2 核酸均無擴(kuò)增。

林彥星等根據(jù)ASFV 基因組中序列保守穩(wěn)定的B646L 基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了ASFV 核酸RPA 快速檢測(cè)法。結(jié)果顯示， 該法特異性強(qiáng)， 能準(zhǔn)確 檢 測(cè)ASFV 核 酸， 與CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、豬A 型塞內(nèi)卡病毒(SVA) 等滅活病毒核酸無交叉反應(yīng)，敏感性高，最低可檢測(cè)到2×101copies/μL， 檢測(cè)時(shí)間短，15 min 即可完成反應(yīng)，且具有很好的重復(fù)性。繆發(fā)明等[26]建立了一種簡(jiǎn)便、快捷的現(xiàn)地檢測(cè)ASFV 的方法， 該法聯(lián) 合RPA 和LFD 技術(shù)，針對(duì)ASFV P72 基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)兩條引物和一條nfo探針，下游引物5′端標(biāo)記生物素，nfo 探針5′端異硫氰酸熒光素或6-羧基熒光素，3′端帶有阻斷物，序列內(nèi)部標(biāo)記THF 分子，通過引物濃度、RPA 反應(yīng)時(shí)間和溫度等條件的優(yōu)化建立了一種可以用于ASFV 現(xiàn)地檢測(cè)的RPA-LFD 方法。該檢測(cè)方法在38 ～46 ℃恒溫反應(yīng)10 min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)ASF 目的基因的有效擴(kuò)增，與CSFV、PCV2、豬乙型腦炎 病 毒（JEV）、PEDV、PRRSV、PRV 等均無交叉反應(yīng)。RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物直接用LFD 肉眼觀察，最低檢測(cè)限為102拷貝/ 反應(yīng)，靈敏度與TaqMan 熒光定量PCR 相當(dāng)。

8 小結(jié)

非洲豬瘟是國(guó)際公認(rèn)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病，世界各國(guó)均高度重視，豬場(chǎng)一旦發(fā)病，按國(guó)家政策應(yīng)全部撲殺。目前該病在我國(guó)全國(guó)均有流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊，使養(yǎng)豬人喪失養(yǎng)豬信心。我國(guó)是以散戶為主的養(yǎng)殖模式，居民普遍喜食熱鮮肉，由此產(chǎn)生大規(guī)模生豬調(diào)運(yùn)，注定非洲豬瘟的防控工作必將是一場(chǎng)持久戰(zhàn)。雖然該病已流行近百年，但對(duì)其致病機(jī)理尚不明確，因病原獨(dú)特性質(zhì)，疫苗研究未取得突破性進(jìn)展，甚至其消毒劑及診斷制品的研究還不完善，還有大量工作要做。該病雖然在全國(guó)范圍多點(diǎn)散發(fā)，但傳播速度非常慢，早期診斷后，通過相應(yīng)的消毒及生物安全防控措施可將豬場(chǎng)損失降低。為開展非洲豬瘟分子流行病學(xué)調(diào)查，了解病毒傳播途徑，掌握疾病流行動(dòng)態(tài)，防止疫情擴(kuò)散和蔓延，需依靠大量快速、敏感、成本低、操作簡(jiǎn)單的高質(zhì)量檢測(cè)試劑。

當(dāng)前ASFV 分子生物學(xué)檢測(cè)方法有多種，但各有利弊，探針檢測(cè)法雖然可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，一次可檢測(cè)大量樣本，但操作較復(fù)雜。納米PCR 方法雖然檢測(cè)速度快、敏感性高、特異性強(qiáng)，但不能實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的定量檢測(cè)，且納米材料不易獲得。多重PCR 方法，雖然可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種疾病的快速篩查，但因所用引物眾多，反應(yīng)條件很難兼顧，致檢測(cè)敏感性不高，易導(dǎo)致漏檢。熒光PCR 檢測(cè)方法較成熟，檢測(cè)速度快，可實(shí)現(xiàn)病原定量檢測(cè)，但染料法特異性不好，很難篩選到好的引物，探針法探針合成價(jià)格較貴，且需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備，很難在基層大面積推廣應(yīng)用。LAMP 方法雖然簡(jiǎn)單、方便，適合基層進(jìn)行推廣應(yīng)用，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，且靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)非特異性擴(kuò)增也很難鑒別。微滴數(shù)字PCR探針的設(shè)計(jì)同熒光PCR，原理復(fù)雜，操作過程對(duì)人員要求高，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低可檢測(cè)單拷貝核酸分子，可實(shí)現(xiàn)待檢靶樣品核酸絕對(duì)定量，目前普及程度不如熒光PCR，同樣不適合基層檢測(cè)。重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)所用試劑價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，引物設(shè)計(jì)規(guī)則不明。

當(dāng)前，對(duì)ASF 無有效疫苗和治療藥物可用，只能靠嚴(yán)格的生物安全措施防控，制定嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，并嚴(yán)格執(zhí)行，規(guī)范引種與賣豬流程，進(jìn)出車輛嚴(yán)格消毒。人員按規(guī)定隔離、消毒和換洗衣物。加強(qiáng)豬飼養(yǎng)管理，提供適宜溫度、濕度，降低豬只飼養(yǎng)密度，豬舍分割成小單元飼養(yǎng)，減少豬群應(yīng)激。進(jìn)出豬場(chǎng)飼料、藥品、疫苗、物資等嚴(yán)格熏蒸消毒，豬舍定期清理糞尿，做好滅蚊蠅及滅鼠工作。選擇質(zhì)量有保證的廠家對(duì)ASFV 有確定效果的消毒劑，如過硫酸鉀復(fù)合物、戊二醛等，消毒劑配制濃度要合理，保證消毒時(shí)間，并注意外界環(huán)境溫度，部分消毒劑在低溫環(huán)境無效。

因我國(guó)流行的ASFV 為強(qiáng)毒株，豬群常在抗體還未產(chǎn)生或抗體滴度不高時(shí)豬只已死亡，全球?qū)Ψ侵挢i瘟都是撲殺政策，所以當(dāng)前檢測(cè)抗體的意義并不大，主要針對(duì)抗原檢測(cè)。隨著疾病的流行，ASFV 可能會(huì)變?yōu)槿醵局辏i只出現(xiàn)隱性帶毒情況，到時(shí)檢測(cè)抗體可能更有意義。雖然針對(duì)ASFV 病原檢測(cè)方法有多種，但當(dāng)前國(guó)家推薦的檢測(cè)方法是熒光PCR，國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織了比對(duì)，推薦了一些質(zhì)量符合要求的廠家。檢測(cè)時(shí)可選取全血、血清、唾液、糞便、扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟等樣本，通常唾液中最早出現(xiàn)病毒，適合疾病早期篩查，一定要把握檢測(cè)時(shí)間，早發(fā)現(xiàn)、早剔除，減少豬舍中病原載量，否則可能就沒有意義。另外對(duì)檢測(cè)的唾液樣品最好不離心、不凍融，盡早檢測(cè)，以提高檢出率，否則可能會(huì)因核酸降解及病毒量減少造成漏檢?；铙w檢測(cè)排查針對(duì)病原可采集血樣，采樣時(shí)一定要防止豬只間交叉污染，全血的檢出率要高于血清。

雖然公認(rèn)病豬脾臟為檢測(cè)的最佳組織，但一般不建議對(duì)疑似發(fā)病豬只解剖，以免造成大的污染面，可在腹股溝淋巴結(jié)切開一小口，取少量淋巴結(jié)檢測(cè)。如果條件允許的話不要選擇免核酸提取試劑盒，免核酸提取試劑盒雖然對(duì)病毒含量高的樣本擴(kuò)增無影響，但對(duì)環(huán)境采樣或?qū)Σ《竞康偷臉颖荆倭撕怂岬母患图兓^程，必然會(huì)減少樣本陽(yáng)性檢出率。核酸手提法操作繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人員和儀器設(shè)備要求高，商品化核酸提取試劑盒分為柱式提取法和磁珠提取法兩種，磁珠法更適合大量樣本用核酸自動(dòng)提取儀提取，不同廠家柱式法試劑提取效率不同。便攜式熒光檢測(cè)試劑及適合常溫保存和運(yùn)輸?shù)脑噭┰诨鶎蛹膊〉脑\斷中必將發(fā)揮巨大的作用。相信，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，科研工作者一定會(huì)開發(fā)出更多價(jià)廉、質(zhì)優(yōu)的檢測(cè)試劑，以滿足基層豬場(chǎng)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需求，從而更好地防控非洲豬瘟，減少豬場(chǎng)損失，保障我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。