新藥非臨床安全藥理學(xué)研究進(jìn)展

郭健敏，許彥芳，馬玉奎，胡曉敏，黃芳華，扈正桃，宮麗崑，姜德建，張立將，張雪峰，蔡 青，湯納平，宗 英，蘇筱琳，張文強(qiáng)，陸 兢，趙 斌，聶 昕，蒙飛彪，楊 威，王三龍，陸國才，汪巨峰

（1.廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東 廣州 510990；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，河北 石家莊，050017；3.山東省藥學(xué)科學(xué)院新藥評(píng)價(jià)中心，山東 濟(jì)南 250100；4.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，北京 100022；5.成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041；6.中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203；7.湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410331；8.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評(píng)價(jià)研究中心，浙江 杭州 310053；9.江蘇鼎泰藥物研究股份有限公司，江蘇 南京211800；10.康龍化成（北京）新藥技術(shù)股份有限公司，北京 100176；11.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 200120；12.蘇州華測(cè)生物技術(shù)有限公司，江蘇 蘇州 215300；13.美國DSI公司，上海 201203；14.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心，北京 100176）

安全藥理學(xué)（safety pharmacology）作為新藥研發(fā)的一個(gè)重要組成部分，主要是評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)藥物在臨床試驗(yàn)前的毒副作用，探討藥物劑量≥治療劑量時(shí)，潛在的不期望出現(xiàn)的對(duì)生理功能的不良反應(yīng)。通過不斷出現(xiàn)的新技術(shù)和新方法進(jìn)行自我更新，適應(yīng)藥物安全性評(píng)價(jià)的要求，其結(jié)果也會(huì)不斷促進(jìn)藥物研發(fā)和安全性評(píng)價(jià)。對(duì)于各個(gè)系統(tǒng)和器官的安全藥理評(píng)價(jià)并不是一個(gè)獨(dú)立的過程。隨著技術(shù)的革新，多個(gè)系統(tǒng)或器官可以在一個(gè)試驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，遙測(cè)系統(tǒng)的發(fā)展使得一個(gè)安全藥理試驗(yàn)既可以檢測(cè)心血管功能，也可以檢測(cè)呼吸系統(tǒng)功能，同時(shí)與攝像系統(tǒng)合用后還可以評(píng)價(jià)新藥對(duì)部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的影響。由于新藥的特點(diǎn)，有些安全藥理實(shí)驗(yàn)不易或者不必獨(dú)立進(jìn)行，而是整合到毒理試驗(yàn)中，使從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采集到的數(shù)據(jù)最大化，如生物技術(shù)藥。但是與毒理實(shí)驗(yàn)的整合也要考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)操作等因素。

目前，新藥的安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)主要集中在非臨床階段，但需要將臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)的不良反應(yīng)以及藥物上市后人群出現(xiàn)的不良反應(yīng)與非臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)整合，這樣以轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)為背景的安全藥理策略必然會(huì)促進(jìn)藥物研發(fā)，增強(qiáng)非臨床安全藥理數(shù)據(jù)的有效性，為藥物研發(fā)的各個(gè)階段的決定提供有力的證據(jù)。未來的安全藥理學(xué)將依賴于藥物的開發(fā)、科學(xué)和技術(shù)的進(jìn)步及管理上的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)等的進(jìn)步，新的藥物作用靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)。有些全新的靶點(diǎn)，應(yīng)用當(dāng)前技術(shù)可能或不能檢測(cè)出有害效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。故在藥物的研發(fā)過程中，安全藥理學(xué)面臨新的挑戰(zhàn)，是在用非臨床研究模型評(píng)價(jià)新藥時(shí)，如何研究和建立新的安全風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)方法和手段，以識(shí)別可能對(duì)人類產(chǎn)生的安全風(fēng)險(xiǎn)。本文從指導(dǎo)原則到新技術(shù)、新方法，全面綜述新藥非臨床安全藥理學(xué)的研究進(jìn)展。

1 安全藥理學(xué)相關(guān)指導(dǎo)原則

美國、歐盟和日本，擁有較成熟和完善的藥品監(jiān)督體系和制藥產(chǎn)業(yè)，該三方于1990年發(fā)起成立了ICH（International Conference on the Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use）。2015年10月，ICH全稱更名為“International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use（國際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)）”，其發(fā)布的技術(shù)指南已經(jīng)成為國際藥品注冊(cè)領(lǐng)域的核心規(guī)則制訂機(jī)制。

2017年6月，我國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）成為ICH正式成員。2018年6月當(dāng)選為ICH管理委員會(huì)成員。中國將逐步適應(yīng)并于2020年5月1日起全面實(shí)施ICH的各級(jí)指導(dǎo)原則。

1.1 lCH對(duì)安全藥理學(xué)研究的總體要求

安全藥理學(xué)作為新藥非臨床安全性評(píng)價(jià)系統(tǒng)中一項(xiàng)重要組成部分，一直受到各國藥品監(jiān)督管理部門和新藥研發(fā)人員的重視和關(guān)注。1997年7月，ICH發(fā)布了《M3：支持藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)和上市的非臨床安全性研究指導(dǎo)原則》和《S6：生物技術(shù)藥物的非臨床安全性評(píng)價(jià)》。ICH M3中指出，安全藥理學(xué)研究包括對(duì)重要生命功能的評(píng)估，如心血管系統(tǒng)、CNS和呼吸系統(tǒng)。ICH S6提出，安全藥理學(xué)研究應(yīng)采用合適的動(dòng)物模型，考察藥物對(duì)生理功能潛在的非預(yù)期作用。M3和S6均要求，在非臨床安全性評(píng)價(jià)中必須進(jìn)行安全藥理學(xué)研究，用于支持藥物的人體臨床研究[1-2]。

2000年11月，ICH正式發(fā)布了《S7A：人用藥物安全藥理學(xué)研究指導(dǎo)原則》。該指導(dǎo)原則統(tǒng)一和規(guī)范了安全藥理學(xué)研究的定義、目的、試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)內(nèi)容和相應(yīng)的技術(shù)方法，在全世界范圍內(nèi)促進(jìn)了新藥安全藥理學(xué)這一學(xué)科的形成和發(fā)展[3]。

2014年5月，CFDA緊跟國際前沿，基本參照ICH S7A要求，頒布了《藥物安全藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，旨在進(jìn)一步提升我國安全藥理學(xué)的研究規(guī)范和技術(shù)要求[4]。

1.2 lCH對(duì)于非臨床評(píng)價(jià)QT間期延長(zhǎng)的特別要求

1.2.1 S7B

藥物延長(zhǎng)心電圖QT間期引發(fā)心律失常，特別是致命性的尖端扭轉(zhuǎn)性室性心動(dòng)過速（Torsades de Pointes，TdP）的風(fēng)險(xiǎn)已被新藥研發(fā)行業(yè)廣泛認(rèn)知。2005年5月，ICH正式頒布《S7B：人用藥物延遲心室復(fù)極化（QT間期延長(zhǎng)）潛在作用的非臨床評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》[5]。該指導(dǎo)原則主要提供了關(guān)于藥物QT間期的非臨床研究及綜合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略，制定心室復(fù)極化延遲和QT間期延長(zhǎng)研究方案，是關(guān)于心臟非臨床安全性評(píng)價(jià)的框架性指南。鑒于藥物對(duì)快激活延遲整流鉀電流〔IKr，其通道由human Ether-a-go-go related gene（hERG）編碼〕的抑制作用是藥物引發(fā)人QT間期延長(zhǎng)的主要機(jī)制，所以S7B中體外試驗(yàn)主要推薦采用原代心肌細(xì)胞或表達(dá)hERG通道的人源細(xì)胞來評(píng)價(jià)藥物對(duì)IKr的影響。同期，ICH還發(fā)布了與S7B相關(guān)的臨床試驗(yàn)指南《E14：非抗心律失常藥致QT/QTc間期延長(zhǎng)及潛在致心律失常作用的臨床評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則》[6]，規(guī)范了在臨床研究中如何確定新藥的心臟安全性。S7B和E14中關(guān)于非臨床和臨床研究評(píng)價(jià)的結(jié)合，有助于促進(jìn)人們對(duì)新藥致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)作出整體性的判斷。

2014年5月，CFDA基本參照ICH S7B要求，頒布了《藥物QT間期延長(zhǎng)潛在作用非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]，保證了我國藥品監(jiān)管部門對(duì)安全藥理學(xué)研究要求的國際一致性。

1.2.2 E14/S7B Q&A及其修訂

近年來，以hERG鉀通道阻斷和QT/QTc延長(zhǎng)為核心的評(píng)估策略逐漸暴露出其局限性。與此同時(shí)，借助各種電生理、分子生物學(xué)以及光成像等技術(shù)手段，人們對(duì)心律失常機(jī)制認(rèn)識(shí)不斷深入。為此，美國FDA在2014年提出了綜合性離體致心律失常風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略（Comprehensivein vitroProarrhythmia Assay，CiPA），推動(dòng)了ICH E14/S7B的修訂。新的CiPA主要根據(jù)藥物對(duì)多通道的影響由計(jì)算機(jī)模擬系統(tǒng)預(yù)測(cè)致心律失常的風(fēng)險(xiǎn)高低。CiPA建議研究?jī)?nèi)容包括3部分：第1部分是在體外（可利用表達(dá)克隆的人各種離子通道蛋白的細(xì)胞系）評(píng)價(jià)藥物對(duì)心肌Na+、K+（包括IKr，IKs和IK1）和Ca2+等多種離子通道的影響；第2部分是計(jì)算機(jī)模擬系統(tǒng)預(yù)測(cè)藥物對(duì)上述各種通道的作用將如何影響心肌細(xì)胞動(dòng)作電位（action potential，AP）；第3部分是在人源干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞（human embryonic stem cells derived cardiomyocytes，hSC-CM）上驗(yàn)證藥物對(duì)電生理的影響[8-10]。

2018年11月，ICH大會(huì)正式核準(zhǔn)成立E14/S7B實(shí)施工作組（Implementation working group，IWG）來修訂E14/S7B Q&A，其分別于2018年11月11-17日在美國夏洛特會(huì)議和2019年6月3-6日的荷蘭阿姆斯特丹會(huì)議上，制定了相關(guān)技術(shù)文件草案。美國夏洛特會(huì)議主要內(nèi)容為CiPA：計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)、離子通道技術(shù)、數(shù)據(jù)的分析方法及標(biāo)準(zhǔn)化，細(xì)胞的來源、對(duì)照、參考化合物和人源干細(xì)胞在CiPA中的作用，人誘導(dǎo)多能心肌干細(xì)胞的方法學(xué)驗(yàn)證，及人體心肌細(xì)胞模型預(yù)測(cè)心律失常等。荷蘭阿姆斯特丹會(huì)議主要內(nèi)容：體外試驗(yàn)的回顧及試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)質(zhì)量的一致性、心律失常模型、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的Q&A及決策樹、大分子藥物進(jìn)行QT研究的方法、E14風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的Q&A-低生物利用度/高心率藥物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及綜合分險(xiǎn)評(píng)估等[8-9]。

根據(jù)ICH IWG會(huì)議精神，E14/S7B Q&A的具體內(nèi)容將主要包括：①離體實(shí)驗(yàn)/數(shù)據(jù)收集、分析及解釋規(guī)范；②S7B核心組合在體試驗(yàn)的考慮；③計(jì)算機(jī)模型、離體及在體試驗(yàn)等促心律失常模型的原理，以及在體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)化及敏感性、濃度-QT分析；④結(jié)合S7B和E14進(jìn)行綜合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的實(shí)例回顧；⑤對(duì)心律有影響的藥物、不能進(jìn)行TQT研究的抗腫瘤藥物的要求；⑥大分子藥物的考慮：確定不需要進(jìn)行QT評(píng)估的“大分子”的閾值等；⑦心電圖指標(biāo)數(shù)據(jù)：臨床和非臨床生物學(xué)指標(biāo)，回顧性、前瞻性分析，數(shù)據(jù)來源、分析與解釋；⑧建立決策樹等。ICH后續(xù)將進(jìn)行征求意見的審議并修訂E14/S7B的Q&A。修訂工作具體分2個(gè)階段完成：①階段1：主要明確如何將體外（in vitro）、計(jì)算機(jī)模型（in silico）和體內(nèi)（in vivo）試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和應(yīng)用的問答；并考慮這些推薦方法對(duì)臨床評(píng)價(jià)的影響（當(dāng)E14臨床評(píng)價(jià)方法有疑問時(shí)），如臨床QT評(píng)估受心率變化影響、臨床不能檢測(cè)超治療濃度、無安慰劑組等。②階段2：主要包括對(duì)S7B和E14創(chuàng)建預(yù)測(cè)算法或模型結(jié)果的Q&A，標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)方法（計(jì)算機(jī)模型和體外人肌細(xì)胞研究中，提供實(shí)驗(yàn)條件、數(shù)據(jù)質(zhì)量和報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)），預(yù)測(cè)心律失常模型的指標(biāo)，提供心電圖和（或）不良事件數(shù)據(jù)的臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)和解釋信息，使用人心肌細(xì)胞評(píng)估藥物的電生理效應(yīng)，心律失常模型及心電圖生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)，詳細(xì)定義可能不需要QT重點(diǎn)臨床評(píng)估的低/或無風(fēng)險(xiǎn)測(cè)試項(xiàng)目，并對(duì)需要額外數(shù)據(jù)的建議等方面進(jìn)行確定。E14/S7B Q&A修訂工作目前尚處于階段1，計(jì)劃2020年6月完成對(duì)階段2討論稿的審議，并確定最終Q&A的發(fā)布時(shí)間表[8-10]。

2 中樞神經(jīng)系統(tǒng)安全藥理學(xué)研究

2.1 體內(nèi)外評(píng)價(jià)模型

近年來，隨著對(duì)藥物神經(jīng)系統(tǒng)毒性的越發(fā)重視，CNS安全藥理的早期篩查也越來越受到重視，其中以細(xì)胞培養(yǎng)/組織培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，利用生物化學(xué)、分子學(xué)、電生理學(xué)、形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)以及各種組學(xué)技術(shù)對(duì)毒物暴露致神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能損傷的體外評(píng)價(jià)系統(tǒng)得到了很好的發(fā)展。如細(xì)胞模型，除了常用的LUHMES和PC12細(xì)胞，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞近年來已被廣泛用于神經(jīng)疾病發(fā)病機(jī)制和神經(jīng)發(fā)育毒性的研究，神經(jīng)干細(xì)胞模型則能通過藥物對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體外生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的影響來評(píng)價(jià)其可能存在的神經(jīng)毒性等[11-14]。

ICH S7A要求的哺乳動(dòng)物體內(nèi)CNS評(píng)價(jià)測(cè)試方法主要包括Irwin或功能觀察組合（functional observational bakery，F(xiàn)OB）實(shí)驗(yàn)，一般以小鼠或大鼠為測(cè)試系統(tǒng)。隨著近年來生物技術(shù)藥物持續(xù)的研發(fā)熱潮，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為許多抗體或蛋白類藥物的藥理相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，是非臨床安全性評(píng)價(jià)中的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)于猴為唯一藥理學(xué)相關(guān)種屬的藥物，猴FOB實(shí)驗(yàn)在評(píng)價(jià)藥物對(duì)CNS的潛在作用時(shí)具有重要意義。Gauvin等[11]于2008年報(bào)道了猴FOB試驗(yàn)方法，至今多個(gè)國際和國內(nèi)合同研究組織（contract research organization，CRO）在其基礎(chǔ)上建立了自己的猴FOB實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。由于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的藥效或毒性反應(yīng)易受到社會(huì)變量的影響，為此群居條件下所獲得的數(shù)據(jù)更為接近人類精神神經(jīng)行為和疾病過程。而應(yīng)用視頻跟蹤系統(tǒng)獲得圖像后定量分析神經(jīng)系統(tǒng)指標(biāo)變化，將獲得更為準(zhǔn)確的評(píng)估結(jié)果，為此是否能利用人工智能學(xué)習(xí)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展對(duì)試驗(yàn)中的視頻結(jié)果（如動(dòng)物行為學(xué)變化，甚至是面部特征變化）進(jìn)行記錄和評(píng)價(jià)等成為該領(lǐng)域的拓展方向。

2.2 計(jì)算毒理學(xué)與人工智能技術(shù)在綜合評(píng)估的應(yīng)用

“21世紀(jì)毒性測(cè)試和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的愿景”旨在通過定量的體外到體內(nèi)外推（quantitativein vitroin vivoextrapolation，QIVIVE）增加人類相關(guān)體外模型系統(tǒng)的使用[15]，以減少、完善并最終取代動(dòng)物模型的使用。在20世紀(jì)之初，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型已被報(bào)道用于化合物神經(jīng)系統(tǒng)毒性的高通量早期篩查，隨后越來越多的計(jì)算模型被應(yīng)用到安全風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)和評(píng)估中，得到快速發(fā)展和應(yīng)用。用建模和仿真來實(shí)現(xiàn)毒理評(píng)估的轉(zhuǎn)化，能夠觀察到這些毒性效應(yīng)的相關(guān)濃度從體外到體內(nèi)的情況。例如，分布生物動(dòng)力學(xué)建模可以從體外細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)中測(cè)試化合物的合成，可以預(yù)測(cè)游離培養(yǎng)基的濃度和細(xì)胞內(nèi)濃度。相應(yīng)的理化性質(zhì)（如logPow、pKa和溶解度）和化合物設(shè)立體外測(cè)定的條件（如細(xì)胞類型、細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)基組成），均被認(rèn)為是與推動(dòng)體外到體內(nèi)定量的轉(zhuǎn)化毒理學(xué)終點(diǎn)密切相關(guān)?；谌淼纳韺W(xué)藥代/生理學(xué)毒代動(dòng)力學(xué)（physiologically based pharmacokinetic/physiologically based toxicokinetic，PBPK/PBTK）建模和仿真是可以預(yù)測(cè)人體對(duì)化合物的全身和組織暴露的非臨床動(dòng)物模型。因此，PBPK/PBTK模型不僅可以告知體外毒代動(dòng)力學(xué)到體內(nèi)的轉(zhuǎn)化，也有助于從動(dòng)物到人類的種屬間的轉(zhuǎn)化。整合這2個(gè)模型方法，體外確定的有效濃度可以被校正為與體內(nèi)相關(guān)的驅(qū)動(dòng)濃度，然后，通過反向劑量法將其轉(zhuǎn)換為人等效劑量下的血漿濃度或目標(biāo)組織濃度，通過模擬可以預(yù)測(cè)被鑒定為有害的體外PBTK模型。Bal-Price等[15-16]應(yīng)用不良結(jié)局路徑（adverse outcome pathway，AOP）概念，對(duì)已知對(duì)于CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要的多種細(xì)胞和分子過程進(jìn)行了總結(jié)，由于CNS和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)和功能復(fù)雜性，在化學(xué)暴露導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)不良結(jié)局的途徑之間建立起因果關(guān)系和定量關(guān)系一直具有挑戰(zhàn)，而這種作用機(jī)制明確的綜合測(cè)試和評(píng)估方法（IATA）可能具有開發(fā)前景。

2.3 核心組合安全藥理實(shí)驗(yàn)

CNS核心組合實(shí)驗(yàn)是一些常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)化的快速測(cè)試，這些測(cè)試通常也可在藥物研發(fā)的早期階段被用于測(cè)試先導(dǎo)化合物是否有潛在的CNS風(fēng)險(xiǎn)。這類早期測(cè)試通常在大鼠上進(jìn)行。ICH S7A主要建議的核心組合實(shí)驗(yàn)包括臨床觀察、自發(fā)活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)。日本指導(dǎo)原則的第一級(jí)研究中除了S7A的建議外，還包括了驚厥閾值、與安眠藥的相互作用和疼痛閾值的測(cè)定。ICH SA7中建議這類核心組合實(shí)驗(yàn)均應(yīng)參照藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（Good Laboratory Practice，GLP）法規(guī)執(zhí)行。

實(shí)際上，類似Irwin和FOB實(shí)驗(yàn)這種利用標(biāo)準(zhǔn)化方式對(duì)藥物進(jìn)行系統(tǒng)地觀察的方法原則上可以使用于其他動(dòng)物種類（甚至可以用于人）。而ICH S7A中也提到可以使用功能組合實(shí)驗(yàn)作為CNS核心組合實(shí)驗(yàn)[17-18]。

2.4 補(bǔ)充和追加安全藥理實(shí)驗(yàn)

這類研究的范圍涉及更廣泛，通常會(huì)涵蓋認(rèn)知功能（學(xué)習(xí)、記憶和注意力）、腦電圖（electroencephalogram，EEG）和藥物依賴/濫用測(cè)試。由于這類研究的復(fù)雜性，目前還無法將其標(biāo)準(zhǔn)化，故未要求其必須遵循GLP，但必須按照國際公認(rèn)的科學(xué)的方法進(jìn)行。

2.5 EEG研究

電生理學(xué)范圍廣泛，涵蓋從體外研究如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外到整個(gè)動(dòng)物的體內(nèi)研究如EEG。EEG研究本身是一個(gè)非常寬泛的概念，涉及到大腦電活動(dòng)的各個(gè)方面，從頭蓋骨外的表層記錄到腦內(nèi)的深度電極記錄（自發(fā)性生物電位）。而作為追加的CNS安全藥理研究，EEG研究主要涉及清醒自由活動(dòng)動(dòng)物的定量EEG（quantitative EEG，qEEG）和睡眠/覺醒周期[19]。

2.6 評(píng)價(jià)新技術(shù)

腦成像、神經(jīng)遞質(zhì)監(jiān)測(cè)和腦電監(jiān)測(cè)等方面的新技術(shù)在近20年來被廣泛地運(yùn)用于腦科學(xué)研究中。比如腦電監(jiān)測(cè)是一個(gè)長(zhǎng)期持續(xù)性的過程，從24 h到幾周，并且需要避免在測(cè)試過程中引入麻醉劑、應(yīng)激反應(yīng)等干擾因素，故植入式遙測(cè)技術(shù)在CNS研究中有著天然的技術(shù)優(yōu)勢(shì)——即使用清醒自由活動(dòng)的動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。遙測(cè)技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)腦電研究、睡眠研究和癲癇研究，輔助研究者做出了許多高質(zhì)量創(chuàng)新研究，并取得了重大成果。

此外，還可以將遙測(cè)系統(tǒng)和視頻監(jiān)測(cè)系統(tǒng)與動(dòng)物行為學(xué)系統(tǒng)聯(lián)合使用。例如，通過優(yōu)化手術(shù)方法，聯(lián)合視頻技術(shù)，建立了可長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)清醒自由活動(dòng)大鼠大腦皮質(zhì)、海馬EEG、肌電圖和行為活動(dòng)度的動(dòng)物模型。該模型首次將遙控監(jiān)測(cè)動(dòng)物腦電圖技術(shù)和視頻技術(shù)（video-telemetric electroencephalography，Video-tEEG）結(jié)合起來，同步研究藥物對(duì)動(dòng)物行為活動(dòng)和EEG的影響，且動(dòng)物可在清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下被長(zhǎng)期連續(xù)監(jiān)測(cè)，這為CNS藥理學(xué)和新化合物安全性評(píng)價(jià)提供了一個(gè)新的強(qiáng)有力的動(dòng)物模型。

未來CNS安全藥理學(xué)的研究趨勢(shì)主要可體現(xiàn)以下幾個(gè)方面：①FOB實(shí)驗(yàn)的不斷完善和標(biāo)準(zhǔn)化：與人類一樣，動(dòng)物也具有社會(huì)行為，群養(yǎng)的動(dòng)物間會(huì)形成從屬關(guān)系，不同階級(jí)的成員之間會(huì)表現(xiàn)出不同的社交行為。與自然界不同的是，對(duì)于在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)的動(dòng)物，一般以單性別為1個(gè)群體，動(dòng)物的社會(huì)行為會(huì)發(fā)生改變。因而，在FOB實(shí)驗(yàn)的籠內(nèi)觀察中，不再只是單純檢查動(dòng)物的一般生理狀態(tài)，更應(yīng)該關(guān)注藥物對(duì)于動(dòng)物行為學(xué)的影響，并增加相應(yīng)的觀察和描述標(biāo)準(zhǔn)，如社會(huì)行為包括玩耍、順從、威脅和攻擊。另外，隨著社會(huì)行為視頻分析手段的不斷發(fā)展，大小鼠步態(tài)分析系統(tǒng)、視頻追蹤、射頻識(shí)別（radio frequency identification，RFID）和行為學(xué)自動(dòng)分析軟件的應(yīng)用能更好地滿足行為學(xué)觀察的時(shí)間要求和指標(biāo)量化，對(duì)于社會(huì)行為的描述變得更加客觀。同時(shí)FOB實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)計(jì)方法也逐漸統(tǒng)一。未來也會(huì)有更多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物例如食蟹猴、Beagle犬等FOB模型越來越完善，更多的應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)核心組合實(shí)驗(yàn)中來。②CNS追加的安全藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)會(huì)越來越成熟，高架十字迷宮、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)測(cè)定及動(dòng)物EEG測(cè)定等實(shí)驗(yàn)技術(shù)也將會(huì)更多地用于行為、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)生化、視覺、聽覺和（或）電生理等指標(biāo)的檢測(cè)。③隨著近年來神經(jīng)生理、神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分泌等研究的不斷深入，新的神經(jīng)毒性生物標(biāo)志物如髓鞘堿性蛋白等也會(huì)逐漸應(yīng)用到藥物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響中[11-19]。

3 心血管系統(tǒng)安全藥理學(xué)研究

3.1 心臟安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)新技術(shù)

鑒于國際上心血管安全藥理方面的發(fā)展方向，正朝著新策略CiPA的方向努力。且從新藥評(píng)價(jià)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)看，體外綜合評(píng)價(jià)技術(shù)，在未來的新藥評(píng)價(jià)中最終將占據(jù)主導(dǎo)地位。

3.1.1 體外離子通道研究

在新藥早期篩選階段，首先要進(jìn)行體外hERG電流實(shí)驗(yàn)。然而參與心肌動(dòng)作電位復(fù)極有多種外向和內(nèi)向電流。一方面，并非所有藥物引發(fā)的心律失常都來自阻斷hERG通道；另一方面，藥物可能同時(shí)影響多種離子通道，對(duì)其他通道的作用將改變hERG鉀通道阻斷帶來的風(fēng)險(xiǎn)程度，如同時(shí)抑制晚Na+電流的失活將增加風(fēng)險(xiǎn)，而同時(shí)抑制晚Na+電流或L型Ca2+電流將降低風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，大約60%具有潛在治療作用的新化合物由于明顯的hERG阻斷，在早期階段停止研發(fā)，而這些化合物不一定具有致心律失常風(fēng)險(xiǎn)。因此，新的CiPA策略要求檢測(cè)對(duì)多種離子通道的影響，CFDA頒布的《藥物QT間期延長(zhǎng)潛在作用非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》亦做出同樣的要求。主要采用原代心肌細(xì)胞或異源表達(dá)細(xì)胞系評(píng)價(jià)藥物對(duì) IKr/hERG，IKs，Ito，INa（包括晚Na+）和ICa-L等的影響[4，7]。

3.1.2 計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)

計(jì)算機(jī)模擬毒理學(xué)，主要是通過建立定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系計(jì)算機(jī)模型（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型來預(yù)測(cè)、闡明化學(xué)物質(zhì)的毒副作用及作用機(jī)制。在心臟方面的安全性評(píng)價(jià)中，可通過計(jì)算機(jī)模擬模型，利用藥物對(duì)多個(gè)離子通道的影響來預(yù)測(cè)藥物對(duì)動(dòng)作電位的影響及致TdP的風(fēng)險(xiǎn)。美國FDA正在致力于促進(jìn)用于心臟安全性評(píng)價(jià)的可靠且經(jīng)過驗(yàn)證的計(jì)算機(jī)模型的發(fā)展[10，20]。

3.1.3 人源干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞技術(shù)及應(yīng)用

人源干細(xì)胞（包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）分化心肌細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)使藥物敏感心律失常細(xì)胞模型的建立得以實(shí)現(xiàn)。研究表明，盡管hSCCM為不成熟的心肌細(xì)胞，這些細(xì)胞具有對(duì)藥物反應(yīng)比較敏感、無種屬差別、急性或慢性孵育、高通量測(cè)定等優(yōu)勢(shì)，特別是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CM）無倫理問題，患者來源hiPSC-CM攜帶疾病特有的遺傳突變特征，為心律失常機(jī)制研究廣為采用。在體外培養(yǎng)的單層hSC-CM上可直接觀察到藥物誘發(fā)早后除極和觸發(fā)電活動(dòng)，為評(píng)價(jià)藥物潛在致心律失常風(fēng)險(xiǎn)提供了良好的細(xì)胞模型。CiPA工作組成立以來的5年多時(shí)間不斷發(fā)布相關(guān)的工作進(jìn)展（https：//cipaproject.org/about-cipa/），以28種臨床驗(yàn)證的高、中、低3類風(fēng)險(xiǎn)致心律失常藥物為驗(yàn)證藥物，系統(tǒng)研究了其對(duì)各種離子通道的影響、比較了其對(duì)多中心不同來源hiPSC-CM和不同記錄方式下（微電極陣列場(chǎng)電位記錄、電壓敏感染料記錄AP）的電生理影響。相信不久的將來CiPA工作組將建立起藥物對(duì)hiPS-CM電生理終點(diǎn)評(píng)價(jià)參數(shù)的實(shí)驗(yàn)規(guī)范流程及系統(tǒng)驗(yàn)證方案[10]。hiPS-CM實(shí)際應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)是其不成熟性，不同來源以及不同的誘導(dǎo)分化、培養(yǎng)條件等造成細(xì)胞電生理的差異性，目前對(duì)國內(nèi)研發(fā)的hiPS-CM尚無系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證資料。

除評(píng)價(jià)藥物致心律失常風(fēng)險(xiǎn)外，hiPS-CM還用于檢測(cè)藥物導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。已經(jīng)報(bào)道多種中、高通量商業(yè)化技術(shù)平臺(tái)測(cè)定藥物對(duì)hiPS-CM的收縮影響，包括基于視頻分析、Ca2+內(nèi)流、細(xì)胞阻抗分析等不同原理設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。除測(cè)定收縮外，還可測(cè)定細(xì)胞存活率、線粒體膜電位、Ca2+瞬變和細(xì)胞膜通透性等多種參數(shù)，從而全面評(píng)價(jià)藥物的潛在心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞微電子芯片技術(shù)是基于檢測(cè)電子傳感器阻抗變化以反映細(xì)胞生理狀態(tài)的新型實(shí)時(shí)心肌細(xì)胞分析系統(tǒng)，其系統(tǒng)的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長(zhǎng)的細(xì)胞檢測(cè)板的底部或細(xì)胞浸潤遷移板的微孔膜。微電子芯片主要通過測(cè)定電阻抗來反映細(xì)胞生長(zhǎng)、伸展、形態(tài)變化、死亡和貼壁程度等一系列生理狀態(tài)。實(shí)時(shí)心肌細(xì)胞分析系統(tǒng)所具備的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集、搏動(dòng)周期的短期和長(zhǎng)期檢測(cè)優(yōu)勢(shì)及系統(tǒng)的高通量，使這一技術(shù)非常適用于候選藥物和各種材料的非臨床心臟安全性評(píng)估。目前，該系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用于心肌細(xì)胞搏動(dòng)、收縮和場(chǎng)電位等方面的研究[21-25]。

3.2 清醒動(dòng)物遙測(cè)技術(shù)

目前主要有2種遙測(cè)技術(shù)：馬甲式遙測(cè)系統(tǒng)（Jacketed External Telemetry，JET）和全植入式遙測(cè)系統(tǒng)（Implanted Telemetry）。JET系統(tǒng)接收動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)主要檢測(cè)ECG和體表溫度，目前多用于毒理實(shí)驗(yàn)中的安全藥理數(shù)據(jù)采集；全植入式遙測(cè)實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)監(jiān)測(cè)ECG、血壓、體溫、心收縮力和血液學(xué)指標(biāo)等等。通過遙測(cè)技術(shù)可以采集到心率和ECG相關(guān)指標(biāo)，如QRS間期、QT間期、ST段和PR間期等。由于PR間期和QT間期容易受到心率、樣本量、噪聲等的影響，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和應(yīng)用的動(dòng)物種屬以及數(shù)據(jù)質(zhì)量的不同，應(yīng)該選取合適的公式進(jìn)行校準(zhǔn)。一般來說，常見的校準(zhǔn)公式有Van de Water公式、Fridericia公式和Bazett公式等。具體使用哪個(gè)公式和校準(zhǔn)方法，還是需要根據(jù)具體的數(shù)據(jù)樣本和質(zhì)量來確定。

植入血壓主要分2種：微創(chuàng)血壓（minimum invasive blood pressure，MIBP）和全植入血壓（implanted blood pressure）。全植入血壓是全植入的遙測(cè)系統(tǒng)中的一部分，主要可以測(cè)量股動(dòng)脈壓或者腹主動(dòng)脈壓，以及左心室壓。左心室壓力的檢測(cè)不僅可以反映血壓的變化而且還可以間接反映左心室肌收縮力的情況。因此，全植入血壓可以較為完整地評(píng)價(jià)心血管系統(tǒng)中的血壓和心收縮力的狀況。

MIBP植入技術(shù)是針對(duì)JET系統(tǒng)不能監(jiān)測(cè)血壓而研究設(shè)計(jì)的。JET系統(tǒng)主要用來監(jiān)測(cè)ECG和體表溫度而不能監(jiān)測(cè)血壓等重要的心血管功能指標(biāo)。最近出現(xiàn)的MIBP植入技術(shù)使JET不僅能夠監(jiān)測(cè)ECG和體表溫度，而且可以監(jiān)測(cè)藥物是否對(duì)血壓造成影響。MIBP植入技術(shù)是指通過手術(shù)將監(jiān)測(cè)血壓的植入子插入動(dòng)物的一側(cè)股動(dòng)脈中或者腹主動(dòng)脈（如果加長(zhǎng)導(dǎo)管）中，然后再將植入子的頭部即發(fā)射器部分縫合在皮下肌肉中。這樣血壓信號(hào)就可以通過導(dǎo)管傳入植入子的發(fā)射器內(nèi)，再通過信號(hào)轉(zhuǎn)換將血壓信號(hào)轉(zhuǎn)換成無線電信號(hào)并通過接收器傳入采集的電腦中。這種技術(shù)既彌補(bǔ)了JET系統(tǒng)不能采集血壓數(shù)據(jù)的缺陷，同時(shí)它與JET系統(tǒng)結(jié)合在一起能夠采集較為完整的心血管方面的安全藥理數(shù)據(jù)。這對(duì)將安全藥理整合到毒理實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)方式有著重要的意義[22，26]。

3.3 心血管安全藥理追加實(shí)驗(yàn)

①血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：對(duì)比格犬、食蟹猴和巴馬豬的血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，提出行業(yè)規(guī)范化意見。促進(jìn)血流動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)在相關(guān)藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用，全面評(píng)估藥物對(duì)心血管系統(tǒng)的作用特點(diǎn)。②規(guī)范并推廣離體血管肌張力實(shí)驗(yàn)和微血管肌張力實(shí)驗(yàn)在新藥評(píng)價(jià)中的應(yīng)用，開展藥物對(duì)血管直接作用的評(píng)價(jià)能力建設(shè)。③離體心臟模型可以直接評(píng)價(jià)藥物對(duì)心電和心肌收縮力等的綜合作用，當(dāng)前在眾多實(shí)驗(yàn)室中均有應(yīng)用[22，26-27]。

4 呼吸系統(tǒng)安全藥理學(xué)研究

4.1 呼吸功能評(píng)價(jià)

目前，非臨床安全性評(píng)價(jià)多采用清醒動(dòng)物無創(chuàng)的方式進(jìn)行呼吸功能檢測(cè)。通過無線遙測(cè)技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在清醒狀態(tài)下各項(xiàng)呼吸參數(shù)，不受麻醉藥物的干擾，所得數(shù)據(jù)更為真實(shí)。

常用方法包括體積描記和全身體積描記，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是檢測(cè)指標(biāo)單一且數(shù)據(jù)易受動(dòng)物活動(dòng)和環(huán)境的影響。另外，由于動(dòng)物馴化機(jī)制不完善，應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致不同研究機(jī)構(gòu)獲得的數(shù)據(jù)差異大、重復(fù)性差。因此，無創(chuàng)方式一般用于核心組合實(shí)驗(yàn)及快速篩選。有創(chuàng)方式包括呼吸電極植入子及麻醉狀態(tài)下的氣管插管術(shù)，前者可以在清醒無干擾的情況下測(cè)量動(dòng)物的呼吸但檢測(cè)指標(biāo)單一，后者檢測(cè)指標(biāo)豐富、靈敏度高但麻醉藥劑量及時(shí)間對(duì)呼吸功能的影響較難把握[28-29]。

近年來，隨著肺功能檢測(cè)手段的不斷進(jìn)步，用于臨床呼吸系統(tǒng)功能檢測(cè)的強(qiáng)迫振蕩肺功能測(cè)定技術(shù)（forced oscillation technique，F(xiàn)OT）也逐步應(yīng)用于非臨床評(píng)價(jià)過程。FOT技術(shù)是將工程學(xué)強(qiáng)迫振蕩技術(shù)用于呼吸力學(xué)方面的測(cè)定，2007年歐洲呼吸協(xié)會(huì)提出了針對(duì)強(qiáng)迫振蕩技術(shù)臨床應(yīng)用的技術(shù)規(guī)范，標(biāo)志著該技術(shù)走向成熟期[30]。FOT技術(shù)使得氣道阻力及肺順應(yīng)性的改變易于檢測(cè)，從而提高了藥物對(duì)呼吸系統(tǒng)毒性檢測(cè)的靈敏度。且FOT設(shè)備本身可作為呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，幫助實(shí)驗(yàn)人員實(shí)施開胸術(shù)測(cè)量肺動(dòng)脈壓，同時(shí)結(jié)合血?dú)鈾z測(cè)，可以獲得較為完整的呼吸系統(tǒng)追加實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。總之，通過該技術(shù)，可以在吸入藥物評(píng)價(jià)、肺纖維化模型、氣道高反應(yīng)性及肺動(dòng)脈壓等檢測(cè)上獲得靈敏度高、一致性好、重復(fù)性佳的數(shù)據(jù)。

全身體積描記法由于對(duì)動(dòng)物無束縛，其數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性上具有很大的優(yōu)勢(shì)。除了常用的檢測(cè)指標(biāo)，如潮氣量、呼吸頻率和每分通氣量外，還可以檢測(cè)包括吸氣和呼氣時(shí)間，吸氣和呼吸時(shí)的峰流量，呼吸暫停時(shí)間（apneic time）和呼吸暫停計(jì)數(shù)和氣道縮窄指數(shù)（enhanced pause，Penh）等。全植入式的呼吸遙測(cè)技術(shù)是將電極埋置在胸廓相應(yīng)位置，在動(dòng)物呼吸運(yùn)動(dòng)時(shí)，胸廓的體積變化引起不同電極間的電勢(shì)發(fā)生改變，從而演算得到呼吸波形，經(jīng)過校準(zhǔn)后，同樣可以測(cè)量主要呼吸參數(shù)，且只需要定期進(jìn)行校準(zhǔn)，和馬甲式遙測(cè)技術(shù)相比，手術(shù)恢復(fù)后的動(dòng)物適應(yīng)性更好。不過該方法需要手術(shù)且對(duì)電極的埋置位置的精確度要求較高，在操作上具有一定難度[28，31-34]。

近年來，隨著新版《藥物安全藥理學(xué)評(píng)價(jià)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的頒布，使用清醒動(dòng)物進(jìn)行遙測(cè)實(shí)驗(yàn)已是大勢(shì)所趨。目前，國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室已能實(shí)現(xiàn)生物信號(hào)遙測(cè)系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒狀態(tài)下檢測(cè)其自由活動(dòng)的多種生理指標(biāo)的變化，且準(zhǔn)確性得到大幅提升，但獲得的指標(biāo)仍僅限于呼吸頻率及呼吸幅度，并未對(duì)呼吸深度進(jìn)行量化，且不能全面反映動(dòng)物肺功能和氣道的反應(yīng)性情況。近年來，隨著藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范在我國的嚴(yán)格執(zhí)行，安全藥理學(xué)的研究發(fā)展也異常迅速，呼吸系統(tǒng)指標(biāo)的檢測(cè)手段也在不斷進(jìn)步。

4.2 肺功能檢測(cè)指標(biāo)

目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性呼吸系統(tǒng)功能研究中，常用測(cè)量指標(biāo)包括潮氣量、呼吸頻率、氣道阻力、肺順應(yīng)性、肺動(dòng)脈壓力、呼氣容積、呼氣流速和彌散系數(shù)等，通過不同的指標(biāo)反映呼吸系統(tǒng)功能的變化。例如，在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物哮喘實(shí)驗(yàn)中，主要對(duì)動(dòng)物的胸內(nèi)壓、氣道流速、潮氣量、氣道阻力和肺順應(yīng)性等進(jìn)行研究。動(dòng)物的胸內(nèi)壓一般通過麻醉動(dòng)物胸腔插管的方式，將帶有壓力傳感器的壓力探針刺入動(dòng)物胸腔，通過壓力探針獲得動(dòng)物的胸內(nèi)壓。氣道流速一般是通過氣管插管的方式獲取，在動(dòng)物麻醉過程中通過動(dòng)物手術(shù)將流速傳感器插入動(dòng)物的氣管，通過流速傳感器獲得動(dòng)物的氣道流速。潮氣量一般是通過封閉體積描記箱技術(shù)，把動(dòng)物放置在密封體描箱中，動(dòng)物胸腔的變化對(duì)體描箱空氣會(huì)產(chǎn)生擠壓效果，通過對(duì)箱體內(nèi)氣體的壓力或流速進(jìn)行分析，即可得到動(dòng)物的潮氣量。根據(jù)動(dòng)物的呼吸狀態(tài)進(jìn)行分類，又可分為自由呼吸和強(qiáng)制呼吸兩種。其中自由呼吸是指動(dòng)物在自主呼吸情況下測(cè)得的肺功能指標(biāo)，強(qiáng)制呼吸是指動(dòng)物在麻醉接上呼吸機(jī)的情況下測(cè)得的肺功能指標(biāo)，前者一般測(cè)得的是動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性，后者測(cè)得的是靜態(tài)肺順應(yīng)性[32-33，35-36]。

5 補(bǔ)充安全藥理學(xué)研究

5.1 胃腸道系統(tǒng)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)主要包括胃排空和腸道推進(jìn)、胃液分泌、胃蛋白酶活性等，胃排空和腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)中所用的指示劑種類繁多，如5%活性碳粉、半固體營養(yǎng)指示劑（明膠、羧甲纖維素鈉、糖、淀粉和著色劑等）、酚紅或伊文思藍(lán)溶液。其中半固體營養(yǎng)指示劑在胃腸道內(nèi)運(yùn)動(dòng)相對(duì)較慢，可適用于有促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)作用的藥物評(píng)價(jià)。酚紅或伊文思藍(lán)溶液較適用于非禁食狀態(tài)下的胃排空實(shí)驗(yàn)，以排除食物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。另外，[13C]辛酸呼吸法同樣可檢測(cè)胃排空功能，此方法是一種非侵入式的檢測(cè)方法，排除了麻醉，生理應(yīng)激狀態(tài)對(duì)胃動(dòng)力的影響。除此之外，還有報(bào)道用清醒自由活動(dòng)動(dòng)物模型進(jìn)行胃腸慢波監(jiān)測(cè)，并測(cè)試給藥后的藥物反應(yīng)[37-40]。

86 動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下隙出血后腦血管痙攣的診斷和治療進(jìn)展 陳榮彬，吳學(xué)銘，趙 亮，韓凱偉，黃承光，于明琨，侯立軍

未來胃腸道補(bǔ)充安全藥理學(xué)的研究趨勢(shì)主要可體現(xiàn)以下幾個(gè)方面：①發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證能夠診斷胃腸道損傷的特異性好、靈敏度高的生物標(biāo)志物會(huì)成為胃腸道系統(tǒng)補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究的重要發(fā)展方向。例如，瓜氨酸有可能作為分析小腸吸收功能的生物標(biāo)志物等。另外，胃泌素、胃動(dòng)素、膽囊收縮素、生長(zhǎng)抑素、血管活性多肽、促胰液素以及P物質(zhì)等胃腸激素水平可反映胃腸功能情況。②胃腸道功能新的檢測(cè)技術(shù)方法應(yīng)用，包括超聲診斷、放射學(xué)、核素顯像、核磁共振、胃腸電圖、生物電阻抗、膠囊內(nèi)鏡和腔內(nèi)測(cè)壓等。盡管這些方法已在臨床應(yīng)用，作為臨床診斷胃腸功能的客觀手段，但是動(dòng)物試驗(yàn)中應(yīng)用較少。未來可針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開發(fā)不同的檢測(cè)儀器和診斷標(biāo)準(zhǔn)，用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道功能的測(cè)定[38-40]。

5.2 泌尿系統(tǒng)

藥源性腎損傷是腎毒理學(xué)研究的重要內(nèi)容，并且評(píng)估藥物對(duì)腎功能的影響也是藥物非臨床評(píng)價(jià)安全藥理學(xué)的研究?jī)?nèi)容之一。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)可包括排尿量、比重、滲透壓、pH、尿液電解質(zhì)、尿蛋白質(zhì)、肌酐排泄量和腎小球?yàn)V過率（菊粉）。對(duì)腎損傷近年來研究熱點(diǎn)主要集中在早期損傷標(biāo)志物的探索，如尿N-乙酰-B-氨基葡萄糖苷酶、血清胱抑素、腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）和β2微球蛋白等。

此外，由于物種間腎藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和代謝酶的表達(dá)和功能差異，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果之間常常出現(xiàn)不一致的情況。因此，人類腎體外模型作為整體實(shí)驗(yàn)的重要補(bǔ)充，得以廣泛應(yīng)用。這些體外模型能夠在新藥研發(fā)早期進(jìn)行較高通量的篩選，更為經(jīng)濟(jì)和高效。目前使用的體外腎毒理學(xué)研究方法主要有離體腎灌流、離體腎單位灌流、腎組織切片、離體腎小球和腎小管節(jié)段模型、體外細(xì)胞模型及芯片腎（kidney-on-a-chip）等。近些年，諸如毒理基因組學(xué)和3D細(xì)胞培養(yǎng)等新技術(shù)的提出，也為體外模型的研究和應(yīng)用開辟了新的方向。對(duì)于腎泌尿功能的檢測(cè)主要通過尿液分析和基于血清的參數(shù)的測(cè)量來評(píng)估，包括腎排泄功能、電解質(zhì)和代謝物等常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。這項(xiàng)研究需要讓動(dòng)物在有溫控的代謝籠中收集尿液。在預(yù)定的時(shí)間間隔內(nèi)，收集尿液用于尿量、電解質(zhì)、尿生化指標(biāo)以及代謝物的分析。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)較為敏感和穩(wěn)定的尿液腎損傷的標(biāo)志物可用于腎功能指標(biāo)的檢測(cè)，如Kim-1等蛋白類生物標(biāo)志物以及微RNA等核酸類生物標(biāo)志物。這些檢測(cè)方法和指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)為提高非臨床腎泌尿功能損傷的檢測(cè)和篩選提供了支持[41-43]。

5.2.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的人腎近曲小管細(xì)胞樣細(xì)胞

近年來，利用干細(xì)胞技術(shù)，將胚胎干細(xì)胞或用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生腎近端小管細(xì)胞用于體外腎毒理學(xué)研究，也展現(xiàn)出了良好前景[44]。

5.2.2 芯片腎

基于微芯片制作技術(shù)和微流控技術(shù)的芯片腎，構(gòu)建了體外的腎仿生環(huán)境，為研究藥物對(duì)腎功能的影響和損傷作用提供了嶄新的平臺(tái)。芯片腎的大小約2 cm2，芯片用微通道模仿了腎單位的近端小管到遠(yuǎn)端小管部分，在體外重現(xiàn)了腎的濾過作用和重吸收作用。微通道內(nèi)多種細(xì)胞共培養(yǎng)，包括腎上皮細(xì)胞、足細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，均是基本的腎單位細(xì)胞類型，借助微流控技術(shù)模擬腎中的灌注，不僅可用來研究藥物的腎毒性，還可以通過與其他組織類型的模型連接，研究藥物暴露后的組織間的相互作用[45]。

5.3 血液系統(tǒng)

藥物對(duì)血液系統(tǒng)影響的研究目前主要是基于外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及血涂片和骨髓涂片等形態(tài)學(xué)檢測(cè)來進(jìn)行研究，而對(duì)于細(xì)胞功能方面的研究相對(duì)較少。對(duì)于紅細(xì)胞功能，目前應(yīng)用較為廣泛且便捷的方法是采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)血液中pH、二氧化碳飽和度以及氧氣飽和度，進(jìn)而對(duì)紅細(xì)胞攜氧功能進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于血小板功能，主要涉及血小板黏附功能檢測(cè)、血小板聚集功能檢測(cè)以及血小板釋放功能檢測(cè)。這些檢測(cè)方法也主要是在臨床血小板功能的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良和驗(yàn)證。近年來，國內(nèi)外對(duì)血小板聚集功能方法研究開發(fā)比較活躍，這與血小板聚集功能在血栓形成過程中的作用密切相關(guān)，也因此受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注[46]。

5.4 肝膽系統(tǒng)

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）的危害性受到越來越多研究者的關(guān)注，亟需合適的體內(nèi)外DILI模型，為新藥的研發(fā)、篩選、DILI的發(fā)病機(jī)制以及藥物發(fā)揮藥效的機(jī)制研究提供條件。目前可以模擬DILI的模型包括體外和體內(nèi)模型，它們各有利弊，從不同的層面為DILI的研究提供基礎(chǔ)。DILI的體外研究模型分別介紹如下。

5.4.1 亞細(xì)胞水平模型

肝微粒體是從肝組織勻漿后得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎片所形成的小型囊泡，富含各種肝藥酶，代表肝中一個(gè)酶系統(tǒng)。它可以代謝各種化學(xué)藥、中草藥等各種異物小分子，代表肝代謝能力的亞細(xì)胞單位。藥物通過與肝微粒體共孵育（47），結(jié)合體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，可為IDILI的體外研究提供一定的方法。

5.4.2 單層細(xì)胞培養(yǎng)模型

單層培養(yǎng)，或可稱為2D平面培養(yǎng)，是指將肝細(xì)胞種到預(yù)先鋪有細(xì)胞外基質(zhì)如膠原、纖連蛋白或人工基底膜等平面上進(jìn)行培養(yǎng)。單層培養(yǎng)的肝細(xì)胞一般都能保持肝功能幾小時(shí)到幾天。然而，單層細(xì)胞培養(yǎng)模型去分化現(xiàn)象嚴(yán)重，肝藥酶代謝能力容易變?nèi)趸蛳?，功能蛋白表達(dá)不完整，只適用于較短期內(nèi)初步篩選可能導(dǎo)致肝損傷的藥物[48]。常用于單層細(xì)胞培養(yǎng)模型的細(xì)胞有原代肝細(xì)胞、L-02細(xì)胞系和HepG2細(xì)胞系等。

5.4.3 三明治培養(yǎng)模型

三明治培養(yǎng)，介于2D培養(yǎng)和復(fù)雜的3D培養(yǎng)之間，肝細(xì)胞被夾在2層基質(zhì)膜如膠原蛋白或人工基底膜之間，可以長(zhǎng)時(shí)間（可達(dá)數(shù)周）維持細(xì)胞活力、形態(tài)以及藥物代謝酶功能，尤其在無血清培養(yǎng)基中會(huì)有更多的膽小管結(jié)構(gòu)形成，是研究膽汁淤積型肝損傷較好的體外模型[49-51]。但是，肝特異性的功能基因表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減弱，肝細(xì)胞去分化過程不能克服。

5.4.4 3D培養(yǎng)模型

3D培養(yǎng)模型可以更加接近體內(nèi)肝模型，目前，研究人員研發(fā)出了一系列3D肝細(xì)胞培養(yǎng)模型，且肝細(xì)胞的種類不局限于人源肝細(xì)胞和原代肝細(xì)胞。如3D多細(xì)胞球體模型，將細(xì)胞重懸在液體基質(zhì)（水凝膠）中進(jìn)一步聚合或采用懸浮滴注技術(shù)產(chǎn)生多細(xì)胞球體，球體直徑一般在50～100 μm。由原代肝細(xì)胞所形成的球體模型長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞活力和形態(tài)，適用于慢性蓄積性致肝損傷藥物體外篩選的研究[52]。

5.4.5 肝芯片體外模型

人體器官芯片（human organs-on-chips）是一種可以在芯片上構(gòu)建的器官生理微系統(tǒng)的技術(shù)，是近幾年快速發(fā)展起來的一門前沿科學(xué)技術(shù)。通過微流控芯片技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)、生物材料和工程學(xué)等多種方法手段的結(jié)合，在體外模擬構(gòu)建含有多種活體細(xì)胞、功能組合界面、生物流體和機(jī)械刺激等復(fù)雜因素的組織器官微環(huán)境，更加真實(shí)地反映人體組織器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征[52-53]。

近年來，研究者已成功構(gòu)建人工肝竇芯片，通過高滲透性的內(nèi)皮間隙結(jié)構(gòu)將原代肝細(xì)胞與外部血竇樣區(qū)域分離，在保持肝特異性功能的同時(shí)，最大程度上接近人體內(nèi)的真實(shí)形態(tài)[51]。也有研究顯示，在構(gòu)建肝芯片模型時(shí)，將成纖維細(xì)胞、肝星形細(xì)胞以及人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞及流體因素參與考慮其中，可以促進(jìn)肝細(xì)胞發(fā)育、白蛋白分泌、糖原合成及藥物代謝等肝功能的發(fā)揮[52-53]。

6 體外安全藥理學(xué)展望

體外安全藥理學(xué)研究在藥物的早期研發(fā)中也具有極其重要的意義，其研究?jī)?nèi)容包括化合物對(duì)受體、酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體以及離子通道的作用。通過將體外安全藥理學(xué)研究和傳統(tǒng)安全藥理學(xué)研究結(jié)合起來，對(duì)臨床后期開發(fā)成功率已經(jīng)顯示出了積極影響，而在藥物發(fā)現(xiàn)過程中，開展體外安全藥理學(xué)研究也能夠產(chǎn)生顯著影響，包括：①在先導(dǎo)化合物的合成/選擇階段鑒定出安全風(fēng)險(xiǎn)并輔助決策；②在先導(dǎo)化合物的優(yōu)化階段指導(dǎo)降低安全風(fēng)險(xiǎn)；③在先導(dǎo)化合物優(yōu)化的末期階段，結(jié)合已經(jīng)獲得的治療劑量下血藥濃度，評(píng)估該暴露量下的安全風(fēng)險(xiǎn)并輔助確定候選化合物；④在非臨床和臨床開發(fā)階段協(xié)助風(fēng)險(xiǎn)管理。

體外安全藥理學(xué)的早期研究范圍主要集中在與藥物靶點(diǎn)密切相關(guān)的少數(shù)幾個(gè)蛋白種類，隨著科技水平和篩選技術(shù)的提高，這個(gè)范圍逐漸覆蓋到了涉及重要生理系統(tǒng)（心血管、呼吸以及中樞神經(jīng)）的多個(gè)蛋白種類，具體蛋白種類的確定，是以存在不良反應(yīng)的上市藥物為分析目標(biāo)，通過研究這些藥物對(duì)不良反應(yīng)關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)蛋白的作用，從而確證哪些蛋白具備安全預(yù)測(cè)能力?；诎⑺估怠⒏鹛m素史克、輝瑞以及諾華四家跨國制藥企業(yè)的相關(guān)數(shù)據(jù)，一個(gè)最小篩選組合已經(jīng)被確認(rèn)，這個(gè)組合中的蛋白大部分源自G蛋白偶聯(lián)受體超家族，包括了12個(gè)亞家族中的24個(gè)蛋白，此外還有7個(gè)離子通道相關(guān)蛋白、6個(gè)胞內(nèi)酶類蛋白、3個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白、2個(gè)核內(nèi)激素受體蛋白以及1個(gè)激酶蛋白，這44個(gè)蛋白被推薦作為化合物的體外安全藥理學(xué)早期評(píng)價(jià)組合。篩選采用的實(shí)驗(yàn)方法主要包含配體結(jié)合試驗(yàn)和功能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，通常情況下，這2類實(shí)驗(yàn)會(huì)先后進(jìn)行，從而形成互補(bǔ)以避免錯(cuò)誤判斷。截至目前，已經(jīng)有一些制藥公司中的實(shí)際案例，顯示早期體外安全藥理學(xué)研究結(jié)果直接影響甚至改變了藥物開發(fā)歷程[54-56]。

從上述內(nèi)容可以看出，體外安全藥理學(xué)研究方向可以大致分為2個(gè)，一個(gè)是以ICH指導(dǎo)原則為主的標(biāo)準(zhǔn)化研究，以hERG通道試驗(yàn)和未來可能要推行的CiPA方案為代表；另一個(gè)則是制藥公司主導(dǎo)的在新藥早期開發(fā)階段進(jìn)行的篩選研究。其中前者將按照規(guī)劃穩(wěn)步推行，后者則處于相對(duì)靈活的情形，直到相關(guān)經(jīng)驗(yàn)累積成熟至形成共識(shí)。逐漸在新藥發(fā)現(xiàn)階段開始加入體外安全藥理學(xué)研究，并根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)逐漸形成體系。體外安全藥理學(xué)的參與程度必將越來越高。

安全藥理學(xué)在新藥研發(fā)和管理藥物批準(zhǔn)過程中，它是一個(gè)被重新引起重視的學(xué)科，當(dāng)代安全藥理學(xué)具有了全新的內(nèi)容和研究范圍。它被認(rèn)為是整個(gè)藥物安全性評(píng)價(jià)的重要組成項(xiàng)目之一，是為病理學(xué)、生物化學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供補(bǔ)充的關(guān)鍵項(xiàng)目，是制藥工業(yè)在藥物研發(fā)中對(duì)藥物安全的一個(gè)新認(rèn)識(shí)。