凋亡及凋亡相關(guān)因子在胎兒生長(zhǎng)受限胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)

姜 丹，于晶功，孫寒冰，于 水，鄒 娜,劉遠(yuǎn)遠(yuǎn),蔣 奇,王夢(mèng)瑤

(1.大連市婦女兒童醫(yī)療中心 病理科，遼寧 大連 116000；2.大連市婦幼保健院 病理科，遼寧 大連 116033)

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是妊娠晚期胎兒出生體重低于同孕齡胎兒平均體重的二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或十百分位數(shù),是常見產(chǎn)科并發(fā)癥及圍產(chǎn)兒死亡的第二大原因，其病因主要包括母體營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)和胎兒遺傳等方面，還有一部分約占40%為不明原因的FGR[1]，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為不明原因的FGR發(fā)生的病理基礎(chǔ)為胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙。胎盤絨毛纖維沉著增加，絨毛間質(zhì)增生，鈣化，纖維素樣壞死增多，絨毛血管減少或消失，部分血管壁增厚，管腔狹窄，甚至閉塞，母體無法通過胎盤供應(yīng)充足的血液給胎兒[2]。有研究證實(shí)在妊娠的整個(gè)階段均存在凋亡，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡異常與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙關(guān)系密切[3]。Fas/Fasl是細(xì)胞外凋亡途徑起始因子及其識(shí)別機(jī)制的主要死亡受體和死亡配體[4]。本實(shí)驗(yàn)通過比較正常妊娠晚期與FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)因子Fas、Fasl的表達(dá)，探討它們?cè)贔GR發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。

1 材料和方法

1.1 材料來源

選取2014年3月至2017年3月大連市婦女兒童醫(yī)療中心正常妊娠晚期(對(duì)照組)及臨床診斷為FGR產(chǎn)婦(實(shí)驗(yàn)組)胎盤各50例，除外患有其它內(nèi)科或產(chǎn)科并發(fā)癥者，產(chǎn)婦年齡25～33歲(30.3±2.5)歲，孕周34～40周(36.5±2.3)周。所有產(chǎn)婦均為單胎剖宮產(chǎn), 無不良嗜好，無特殊病史，產(chǎn)兒均為活胎。所選實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組產(chǎn)婦年齡、孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胎盤取材均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，送檢胎盤分別生理鹽水洗滌3次后10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)取材、石蠟包埋、切片。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡:參考羅氏凋亡試劑盒說明書，切片脫蠟、水化、漂洗，蛋白酶K孵育30 min，過氧化氫浸泡5 min，TUNEL反應(yīng)液暗室37 ℃孵育60 min，PBS沖洗終止反應(yīng)，滴加Converter-POD于37 ℃水浴箱中孵育30 min，最后DAB顯色10 min，蘇木素復(fù)染，封片。光學(xué)顯微鏡下觀察胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡程度，計(jì)算滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡指數(shù)。羅氏Tunel凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自基因科技(上海)有限公司。

1.2.2 免疫組化S-P法檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Fas、Fasl在胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá):參考基因科技Fas、Fasl免疫組化試劑盒說明書，切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，沖洗，過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，加一抗，室溫60 min后，PBS沖洗，加二抗室溫30 min后，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。鼠抗人Fas單克隆抗體、兔抗人Fasl 單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB染色液(聚合物法)均購(gòu)自基因科技(上海)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

凋亡細(xì)胞：光學(xué)顯微鏡下核為棕褐色或棕黃色，細(xì)胞核呈不同程度的固縮，形態(tài)結(jié)構(gòu)多樣，可呈圓形、分葉狀、或不規(guī)則形。凋亡小體：細(xì)胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹細(xì)胞質(zhì)，形成泡狀、花環(huán)狀小體。凋亡指數(shù)：每張切片連續(xù)選取5個(gè)高倍 (×400)視野計(jì)算平均凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為凋亡指數(shù)：AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

免疫組化半定量:光學(xué)顯微鏡下組織細(xì)胞膜或細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒沉積為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍(×400)視野，按照每張切片的陽性細(xì)胞的比例以及著色的深淺進(jìn)行半定量的分析。陽性細(xì)胞著色比例A：<5%，0 分；5%～25%，1 分；26%～50%，2 分；>50%，3 分；著色強(qiáng)度B：無著色或背景染色，0 分；淺棕黃色，1 分；棕黃色，2 分；棕褐色，3 分。積分=A×B，積分0 分記(﹣)；積分1～3 分記(+)；積分4～6 分記(++)；積分7～9 分記(+++)，兩位病理科專職人員檢測(cè)結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床資料年齡及孕周分析、凋亡指數(shù)比較均采用均數(shù)的t檢驗(yàn)；Fas、Fasl的表達(dá)強(qiáng)度用等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)；AI與Fas、Fasl之間相關(guān)性分析采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析；P<0.05記差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡情況

Tunel凋亡檢測(cè)示:兩組均可見到凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組多于對(duì)照組。兩組凋亡指數(shù)分別為(17.64±6.97)%及(56.48±7.98)%，AI在實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組增加，且差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 凋亡相關(guān)因子Fas、Fasl的表達(dá)

Fas、Fasl在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中均見表達(dá)，主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或蛻膜組織中。實(shí)驗(yàn)組胎盤Fas表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖2A、2B。實(shí)驗(yàn)組Fasl表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1，圖3A、3B。

A：實(shí)驗(yàn)組,凋亡細(xì)胞染為棕褐色或棕黃色，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞固縮，染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞核為分葉形或不規(guī)則性，甚至核碎裂。凋亡小體如花環(huán)狀或泡狀小體(箭頭示);B：對(duì)照組,未見明顯凋亡細(xì)胞 圖1 滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡檢測(cè)(×400)Fig 1 Apoptosis of placental trophoblast in experimental and control groups(×400)

組別nFas-++++++陽性(%)Fasl-++++++陽性(%)對(duì)照組501490098001337100實(shí)驗(yàn)組5000248100028220100

采用等級(jí)資料秩和檢驗(yàn)，正常組與實(shí)驗(yàn)組相比： Fas：Z=-9.461，P=0.000；Fasl：Z=-9.162，P=0.000

A:實(shí)驗(yàn)組，終末絨毛纖維素樣壞死，合體結(jié)節(jié)增多，F(xiàn)as表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，70%左右細(xì)胞中等至強(qiáng)陽性，染色為棕黃色至棕褐色；B：對(duì)照組， Fas表達(dá)示80%左右細(xì)胞弱陽性，染色為淺黃色圖2 兩組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞Fas表達(dá)情況(×200)Fig 2 Fas expression in placental trophoblast in experimental and control groups(×200)

A：實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn)asl表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞膜及細(xì)胞漿80%左右細(xì)胞示弱陽性，染色為淺黃色；B：對(duì)照組，F(xiàn)asl 80%左右細(xì)胞中等至強(qiáng)陽性，染色為棕黃色至棕褐色圖3 兩組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞Fasl表達(dá)情況(×200) Fig 3 Fasl expression in placental trophoblast in experimental and control groups(×200)

2.3 實(shí)驗(yàn)組 Fas、Fasl表達(dá)程度與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡程度的相關(guān)性分析

實(shí)驗(yàn)組AI與Fas表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.634,P=0.000)；與Fasl表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.940,P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。

3 討 論

FGR是產(chǎn)科常見并發(fā)癥，目前已明確的主要病因包括母體因素，胎兒遺傳發(fā)育因素，胎盤因素，還有一部分病因不明確。FGR不僅會(huì)引起嚴(yán)重的圍產(chǎn)期并發(fā)癥，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看還會(huì)影響兒童智力發(fā)育及心理健康[5]。胎盤是介于胎兒和母體之間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要器官，胎盤血液灌注不足及功能低下，胎盤一系列病理生理變化均可能在FGR的發(fā)病中起著重要作用[6]。有研究指出病因不明的FGR胎盤中存在凋亡基因[7]，可以使凋亡增加，導(dǎo)致胎盤功能異常，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙，從而影響胎盤對(duì)胎兒的血供，導(dǎo)致FGR的發(fā)生。本研究通過TUNEL法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞存在凋亡增加的現(xiàn)象。

細(xì)胞凋亡又稱程序性的細(xì)胞死亡，是多細(xì)胞個(gè)體正常成熟發(fā)育、維持生理過程所必需的生物學(xué)現(xiàn)象[8]。有研究表明，在整個(gè)妊娠過程，孕婦胎盤都在發(fā)生著不同程度的細(xì)胞凋亡，妊娠早期，細(xì)胞生長(zhǎng)大于細(xì)胞凋亡，有利于胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，隨著妊娠期進(jìn)展，凋亡程度不斷增加，有利于胎兒順利娩出[9]。胎盤細(xì)胞的增殖和凋亡保持動(dòng)態(tài)平衡維持胎盤的正常功能，凋亡的異常引起胎盤功能障礙，病理妊娠的發(fā)生[10]。本研究通過實(shí)驗(yàn)證明FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞存在凋亡增加，可能使胎盤失去自身功能平衡，導(dǎo)致FGR發(fā)生。細(xì)胞凋亡是多因素共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，影響FGR胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)調(diào)控因子主要有哪些，他們對(duì)FGR胎盤凋亡有什么影響，值得我們進(jìn)一步深入探討和研究。

Fas 是I 型跨膜糖蛋白,神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)/腫瘤壞死因子超家族，它是介導(dǎo)凋亡的細(xì)胞表面受體，主要存在于T淋巴細(xì)胞為主的多種組織細(xì)胞。Fas配體(Fasl)屬于腫瘤壞死因子家族，是II型跨膜糖蛋白，與細(xì)胞表面Fas結(jié)合，使表達(dá)Fas的組織細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。正常妊娠期輔助T淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫使機(jī)體微環(huán)境適應(yīng)胎兒的生存及發(fā)育。T淋巴細(xì)胞因子調(diào)節(jié)失衡會(huì)引起病理妊娠的發(fā)生。Fas/Fasl共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)as 信號(hào)的傳導(dǎo)效應(yīng)依據(jù)效應(yīng)細(xì)胞的分化和活性狀態(tài), 介導(dǎo)兩種相反的效應(yīng),在激活早期，加強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞的活性, 在晚期，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。Fas/Fasl的相互作用及介導(dǎo)的信號(hào)途徑, 是目前研究細(xì)胞凋亡的主要內(nèi)容之一, 其調(diào)控凋亡的機(jī)制尚不清楚, 但已確認(rèn)Fas/Fasl是細(xì)胞外凋亡途徑起始因子及其識(shí)別機(jī)制的主要死亡受體和配體[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)Fas/Fasl介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)關(guān)系密切，可能在母兒免疫耐受中有重要作用。在妊娠期，母體內(nèi)出現(xiàn)很多異體抗原，T淋巴細(xì)胞被激活，大量表達(dá)Fas，而Fasl的作用和Fas相反，它與Fas結(jié)合后，導(dǎo)致激活的T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡從而保護(hù)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育[14]。本研究中Fas、Fasl在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中均見表達(dá)，主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞膜、細(xì)胞漿及蛻膜組織中，實(shí)驗(yàn)組胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞Fas表達(dá)明顯高于對(duì)照組，F(xiàn)asl表達(dá)明顯低于對(duì)照組。凋亡相關(guān)因子Fas、Fasl可能共同參與實(shí)驗(yàn)組滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡異常過程，引起凋亡增加，且實(shí)驗(yàn)組凋亡指數(shù)AI與Fas表達(dá)呈正相關(guān)，與Fasl表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。Fas的高表達(dá)及Fasl的低表達(dá)導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加，侵襲障礙，胎盤功能不全，胎盤供血不足，胎兒生長(zhǎng)發(fā)育受限。

隨著二胎政策的開放，高齡產(chǎn)婦增多，F(xiàn)GR發(fā)病率日漸增加，F(xiàn)GR是一個(gè)復(fù)雜的病理妊娠過程，病因多不明確，深入探討FGR發(fā)病機(jī)制，研究凋亡在FGR發(fā)生的意義，可能為FGR病因?qū)W提供新的研究思路，為臨床治療FGR提供研究新靶點(diǎn)，從長(zhǎng)遠(yuǎn)看正確的診斷早期的干預(yù)可能會(huì)降低FGR新生兒并發(fā)癥及死亡率，加強(qiáng)優(yōu)生優(yōu)育。