青藏高原川西北高寒牧區(qū)黑麥青貯飼料中耐低溫乳酸菌的分離與鑒定

李世丹,陳仕勇,馬 莉,王 泰

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041； 2.四川省阿壩州畜牧科學(xué)技術(shù)研究所，四川 汶川 623000)

川西北高寒草地位于青藏高原東緣，草地畜牧業(yè)是該地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)。但由于川西北高寒草地海拔高，氣候寒冷，牧草生長期短，冷季長達(dá)8個(gè)月，一直以來天然草地牧草供給的季節(jié)性不平衡嚴(yán)重制約著草地畜牧業(yè)的高效發(fā)展[1]。因此，在青藏高原川西北牧區(qū)通過人工種草和天然草地打草調(diào)制青貯飼料，不僅是解決冬春季節(jié)飼草料嚴(yán)重不足的有效措施，同時(shí)也是提高畜牧業(yè)生產(chǎn)水平的有效手段[2-3]。

牧草青貯料比青干草較好的保持了牧草的營養(yǎng)價(jià)值，但受青藏高原氣候條件和調(diào)制技術(shù)的制約，使青貯料在草地牧業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用遠(yuǎn)不及青干草廣泛[4]。牧草青貯發(fā)酵進(jìn)程最終應(yīng)是以乳酸菌為優(yōu)勢(shì)的微生物群落演替過程，乳酸菌的種類及其生長特性影響著青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，因而通過對(duì)川西北高寒草地牧草中天然附著的乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定，篩選出適合當(dāng)?shù)貧夂虻膬?yōu)良耐低溫乳酸菌株，開發(fā)出乳酸菌青貯添加劑，對(duì)提升川西北高寒牧區(qū)青貯料調(diào)制技術(shù)和促進(jìn)青貯料的生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義[5]。

目前，青藏高原青貯乳酸菌的多樣性與種質(zhì)資源的研究已備受關(guān)注，其中包括從高原傳統(tǒng)發(fā)酵乳品分離與鑒定乳酸菌的工作[6]，對(duì)高寒地區(qū)野生牧草天然附著乳酸菌進(jìn)行分離鑒定[7]。許冬梅等[8]從青藏高原地區(qū)垂穗披堿草、燕麥等分離出148株乳酸菌，進(jìn)一步分析表明植物乳桿菌、干酪乳桿菌等4種乳酸菌可作為低溫發(fā)酵青貯飼料的備選菌株。崔棹茗等[9]對(duì)青藏高原地區(qū)青稞秸稈青貯飼料中的乳酸菌進(jìn)行了分離，結(jié)果共分離出植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌等4種耐低溫、生產(chǎn)快，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株。在青貯的制作過程中，不同區(qū)域及不同原料青貯中的乳酸菌種類存在差異。目前，對(duì)川西北高寒牧區(qū)青貯乳酸菌的研究較少，也沒有成功研制出一種應(yīng)用于生產(chǎn)的商品乳酸菌青貯添加劑[10-11]。因此，以川西北高寒牧區(qū)飼用黑麥青貯料為材料，從中分離、篩選適合當(dāng)?shù)厍噘A用添加劑的乳酸菌菌株，進(jìn)一步鑒定乳酸菌種類，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為川西北高寒牧區(qū)青貯用乳酸菌添加劑的研制和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試黑麥(Secalecereale)為課題組引種篩選的新品系M1306。供試材料2017年5月6日種植于四川省阿壩州紅原刷金寺鎮(zhèn)阿壩州畜牧科學(xué)技術(shù)研究所試驗(yàn)田。地理座標(biāo)為N 32°01′、E 102°62′，海拔3 351 m，屬大陸性高原寒溫帶季風(fēng)氣候，年均溫1.4℃；年均日照時(shí)數(shù)2 158.7 h；年均降水量749.1 mm，無絕對(duì)無霜期。黑麥生長至初花期，于2017年7月26日刈割鮮草450 kg，晾曬萎蔫，切短至4～5 cm，分層裝填并壓實(shí)于長95 cm、寬58 cm的3個(gè)塑料袋中，用膠帶密封，外套編織袋防護(hù)，存儲(chǔ)在室內(nèi)。青貯60 d后對(duì)3袋青貯料分別取樣0.5 kg，混合真空包裝，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳酸菌的分離與鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離和純化 在無菌操作下取10 g待測(cè)青貯料樣品，剪碎放入裝有100 mL無菌生理鹽水的三角瓶，用震蕩儀器充分振蕩，使樣品附著的乳酸菌分散在液體中，靜置后取上清液配置成7個(gè)梯度的乳酸菌稀釋液。然后取各稀釋液分別涂布在MRS平板培養(yǎng)基上，靜置約30 min，倒置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中低溫厭氧培養(yǎng)48 h，選擇菌落密度適中、生長良好、溶鈣圈明顯的菌落進(jìn)行革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。確定的乳酸菌菌落采用平板劃線法再進(jìn)行純化培養(yǎng)，最后將分離純化后的乳酸菌按1∶1比例保藏在30%的甘油中，-80℃低溫冰箱保存。

1.2.2 乳酸菌菌株16S rDNA測(cè)定 按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)產(chǎn)品使用說明提取乳酸菌全基因組DNA?；蚱螖U(kuò)增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTG-3′)，1492R(5′-TACCTTGTTACGACT-3′)；PCR擴(kuò)增及反應(yīng)按常規(guī)方法進(jìn)行[14]，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 不同梯度溫度生長試驗(yàn) 共設(shè)4、10、15、20、25、30、37、45、50℃ 9個(gè)溫度梯度，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。在無菌操作臺(tái)內(nèi)，用5 mL EP管裝入MRS肉湯液體滅菌培養(yǎng)基，接種3%的活化后的菌液；然后把接種好的乳酸菌對(duì)應(yīng)分組編號(hào)，置于溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，并保證除溫度外其他培養(yǎng)條件相同。每個(gè)溫度下各乳酸菌菌株培養(yǎng)3 d，目測(cè)不同乳酸菌在不同溫度下的生長狀態(tài)，采用4級(jí)記錄符號(hào)(-、±、+、++)記錄結(jié)果，乳酸菌在繁殖時(shí)，菌體主要沉淀在培養(yǎng)基底部，有的則呈絮狀懸浮在培養(yǎng)基中。在觀察時(shí)，培養(yǎng)基底部有明顯乳酸菌集群沉淀，并且培養(yǎng)基內(nèi)，一半以上充滿菌體，呈絮狀懸浮在試管中，則判定為乳酸菌在這個(gè)溫度下生長極好(++)；乳酸菌在培養(yǎng)基底部有沉淀，懸浮的絮狀乳酸菌占培養(yǎng)基的一半，視為乳酸菌生長良好(+)；在培養(yǎng)基底部有少量乳酸菌沉淀，或在培養(yǎng)基中有少量乳酸菌絮狀懸浮，認(rèn)為此時(shí)菌體較少(±)；當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)基本觀察不到乳酸菌沉淀，以及培養(yǎng)基內(nèi)沒有乳酸菌絮狀懸浮，就判定此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)無菌體(-)。

1.2.4 生長曲線繪制 各個(gè)溫度下，不同種乳酸菌均培養(yǎng)3 d，用UV-1800型紫外分光光度計(jì)測(cè)各溫度下不同乳酸菌菌液的D(600 nm)值并記錄，繪制生長標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察乳酸菌對(duì)溫度的耐受性。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用EXCEL 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和曲線圖制作，測(cè)序序列采用CLUSTALW進(jìn)行多重比較，并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌株16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

青貯樣品經(jīng)低溫培養(yǎng)，分離純化，結(jié)合革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗(yàn)，共分離出4株乳酸菌菌株(Y1、Y5、Y7、Y9)。經(jīng)16S rDNA PCR擴(kuò)增序列長度分別大于1 450 bp，在GENEBANK中進(jìn)行16S rDNA基因同源性序列比對(duì)鑒定，與標(biāo)準(zhǔn)乳酸菌菌株序列相似性均達(dá)到了99%。選用4種乳酸菌參考菌株(表1)與分離的乳酸菌菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。經(jīng)過同源比對(duì)及4株乳酸菌菌株聚類結(jié)果分析表明，4株菌株分別為乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸球菌屬(Enterococcus)，其中菌株Y1為清酒乳桿菌(L.sakei)、Y9為彎曲乳桿菌(L.curvatus)、Y5為植物乳桿菌(L.plantarum)、Y7為屎腸球菌(E.faecium)。

2.2 不同溫度下培養(yǎng)基渾濁度及分析

通過目測(cè)不同溫度下在MRS肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后的乳酸菌渾濁度，得到不同溫度下MRS液體培養(yǎng)基的渾濁度目測(cè)結(jié)果(表2)。

表1 構(gòu)建乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹的參考菌株Table 1 Referenced lactic acid bacteria used for construction phylogenetic tree

圖1 基于16S rDNA基因序列建立的乳酸菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rRNA sequences

表2 不同溫度下MRS液體培養(yǎng)基的渾濁度目測(cè)結(jié)果Table 2 Visual measurement results of turbidity of MRS liquid medium at different temperatures

注：++表示生長極好、+表示生長良好、±表示菌體很少、-表示無菌體

在不同溫度培養(yǎng)3 d后，各個(gè)菌株生長情況各不相同，同一溫度下不同菌株生長狀況不同，同一菌種在不同溫度下生長狀況也不相同。4℃時(shí)有2株乳酸菌生長良好，其余2株乳酸菌能微弱生長；10℃時(shí)有3株乳酸菌生長良好，1株乳酸菌菌體較少；15℃時(shí)，3株乳酸菌生長極好，1株乳酸菌良好生長；20～37℃時(shí)所有菌株均生長極好；45℃時(shí)，3株乳酸菌生長極好，1株乳酸菌良好生長；50℃的條件下，所有菌株均生長微弱。試驗(yàn)表明，彎曲乳桿菌和植物乳桿菌生長極好的溫度在15～45℃；清酒乳桿菌生長極好的溫度在15～37℃；屎腸球菌生長極好的溫度在20～45℃。

2.3 乳酸菌在不同溫度處理下的生長趨勢(shì)

乳酸菌經(jīng)過72 h培養(yǎng)，不同溫度下的培養(yǎng)基D(600 nm)值繪制的各菌株在不同溫度下的生長曲線不同(圖2)。溫度在4～20℃時(shí)，4種乳酸菌隨溫度的升高生長量增大，其中植物乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌生長量較大，屎腸球菌生長量相對(duì)較少，20℃時(shí)菌體濃度達(dá)到較高水平；溫度在20～37℃時(shí)，4種乳酸菌的生長量不再增加，均達(dá)到穩(wěn)定，植物乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌菌體濃度稍有增加，屎腸球菌菌體濃度無顯著變化；溫度在37～50℃時(shí)，4種乳酸菌的生長量呈下降趨勢(shì)，乳酸菌活性受到抑制，植物桿菌和彎曲乳桿菌活性最高，清酒乳桿菌活性最低，屎腸球菌稍高于清酒乳桿菌，菌體濃度不高。當(dāng)溫度升至50℃時(shí)，4種乳酸菌的活性均降低到非常低的水平。因此，4種乳酸菌最適生長溫度基本穩(wěn)定在20～37℃，在培養(yǎng)溫度20℃以下低溫范圍，植物乳桿菌對(duì)低溫的耐受性最好，屎腸球菌對(duì)低溫耐受性最低，清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌對(duì)低溫的耐受性居中，4種乳酸菌均有較好的耐低溫表現(xiàn)。

圖2 各乳酸菌在不同溫度下培養(yǎng)72 h生長狀況Fig.2 Growth conditions of lactic acid bacteria in different temperature after 72 h culture

3 討論

3.1 乳酸菌的鑒定

青貯飼料的乳酸菌多樣性受青貯原料種類的影響，不同原料青貯乳酸菌分類鑒定報(bào)道主要有乳桿菌、片球菌、明串珠菌、腸球菌、乳球菌、鏈球菌以及魏斯特氏菌7個(gè)屬[14-15]。試驗(yàn)分離出的4株乳酸菌用形態(tài)觀察及生理生化鑒定方法不能把這些菌株鑒定到種的水平。16S rDNA同源序列分析方法常應(yīng)用于微生物種和亞種的鑒定，當(dāng)2個(gè)鑒定種間的16S rDNA序列同源性大于97.5%，可認(rèn)為是同一種菌[16-17]。把提取的乳酸菌DNA進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)比，4株菌的16S rDNA 序列與參考菌株的16S rDNA 序列相似性都在99%，因此，可以認(rèn)為鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

3.1 溫度對(duì)目測(cè)渾濁度的影響

目測(cè)MRS肉湯液體培養(yǎng)基渾濁度是判定乳酸菌生長情況最直觀的方法，根據(jù)目測(cè)渾濁度等級(jí)確定植物乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和屎腸球菌的最適生長溫度均為20～37℃。低溫會(huì)降低菌體酶活性，高溫會(huì)破壞菌體酶蛋白結(jié)構(gòu)，使得蛋白酶變性，從而讓乳酸菌繁殖受到抑制，菌體濃度降低，所以使得目測(cè)渾濁度降低。在適宜乳酸菌生長的溫度范圍內(nèi)，菌體酶活性高，繁殖速度快，則體現(xiàn)渾濁度大。同一菌株在不同溫度下的繁殖性能不同，則菌液渾濁度觀察結(jié)果不同。然而不同的菌種對(duì)溫度的耐受性不同，所以表現(xiàn)出來的就是不同乳酸菌在同一溫度下不同的渾濁度。以同類方法研究，尚天翠[18]報(bào)道的乳酸菌的最適生長溫度在25～38℃；王夫杰等[19]報(bào)道的3株風(fēng)味乳酸菌生長溫度為32～37℃。

3.2 不同溫度條件對(duì)乳酸菌生長的影響

由于乳酸菌對(duì)溫度的適應(yīng)性不同，則其在不同溫度下的生長狀況各異，在各自適應(yīng)生長的溫度下，繁殖性能良好，隨著溫度的改變，生長適應(yīng)性減弱，繁殖受到抑制。利用20℃低溫篩選出的乳酸菌只有4株，數(shù)量偏少，是低溫抑制了高、中溫菌種的生長活性。低溫會(huì)抑制中溫微生物以及高溫微生物的生長，耐低溫乳酸菌的活性也會(huì)受到抑制。在溫度較低時(shí)，乳酸菌進(jìn)行物質(zhì)代謝交換會(huì)因?yàn)榈蜏丨h(huán)境的刺激而縮小，代謝速率減慢，使得乳酸菌生長活性受到抑制，導(dǎo)致乳酸菌繁殖代謝性能減弱，所以表現(xiàn)為乳酸菌菌體數(shù)量少，D(600 nm)值數(shù)值低。乳酸菌屬于好冷性細(xì)菌，在一定溫度范圍內(nèi)，短時(shí)升溫會(huì)促進(jìn)乳酸菌繁殖。然而，足夠的高溫會(huì)破壞菌體蛋白結(jié)構(gòu)，使蛋白變性失活，從而使得乳酸菌的基數(shù)減少，生長減弱，菌體數(shù)量變少。生長曲線反映出在高溫范圍D(600 nm)值數(shù)值變小，生長曲線呈向下波動(dòng)，菌體的生長迅速衰弱。

4 結(jié)論

植物乳桿菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和屎腸球菌，它們的最適生長溫度為20～37℃；當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，4種乳酸菌的生長量下降，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，4種乳酸菌的生長水平非常低；在20℃以下低溫范圍培養(yǎng)均有較好的耐低溫表現(xiàn)。因此，4種乳酸菌均為耐低溫菌株，有望成為川西北高寒牧區(qū)青貯料調(diào)制用青貯添加劑。