苜蓿-禾草混播方式對播種當(dāng)年牧草抗氧化特性的影響

楊志超，張永亮，石立媛，潘 東

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

利用苜蓿(Medicagosativa)與多年生禾本科牧草混播建立高產(chǎn)人工草地，是發(fā)展草牧業(yè)的重要途徑之一。苜蓿與禾本科牧草混播不僅可以提高牧草產(chǎn)量和條件[1-4]，還能改善土壤質(zhì)量[5-7]。雖然豆禾混播草地表現(xiàn)出許多優(yōu)越性，但因在混播中豆科與禾本科牧草之間存在著養(yǎng)分、水分、光照和空間等競爭因素[8]，如果混播組分競爭力不同，結(jié)果將出現(xiàn)一方逐漸消退，另一方逐漸占據(jù)優(yōu)勢的現(xiàn)象[9-10]。在國內(nèi)對混播草地豆科與禾本科牧草種間競爭機理進行了較多研究，但主要集中在種間競爭效果[8-9,11-13]和混播牧草光合生理特性[14-16]等方面，有關(guān)混播牧草種間競爭脅迫下的抗逆性研究鮮見報道。在田間試驗條件下，通過測定苜蓿與禾草混播后葉片超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性以及脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量等指標來分析不同混播方式下紫花苜蓿與無芒雀麥(Bromusinermis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、虉草(Phalarisarundinacea)和貓尾草(Phleumpratense)的抗氧化特性，為科爾沁沙地苜蓿與禾草混播草地建植提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于西遼河平原內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)牧業(yè)科技示范園區(qū)。試驗地區(qū)為典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫6.4℃，極端最低溫-30.9℃，≥10℃積溫3 184℃，無霜期150 d，年均降水量399.1 mm，生長季(4～9月)降水量占全年的89%。土壤為風(fēng)沙土，土壤有機質(zhì)含量4.86 g/kg，速效鉀94.65 mg/kg，速效磷10.46 mg/kg，堿解氮11.15 mg/kg，pH為8.2。具有噴灌條件，干旱時灌水，各處理每次灌水時間相等。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)混播禾草種類(A因素)和混播比例(B因素)兩個因素?；觳ズ滩莘N類有紫花苜蓿-無芒雀麥、紫花苜蓿-垂穗披堿草、紫花苜蓿-通草1號虉草(P.arundinaceacv.Tongcao No.1)和紫花苜蓿-貓尾草等4種，分別用A1、A2、A3、A4表示；混播比例為1∶1(B1)、2∶2(B2)、1∶2(B3)和2∶1(B4)4個處理，以單播苜蓿和單播禾草為對照。苜蓿單播量15 kg/hm2，無芒雀麥和垂穗披堿草單播量30 kg/hm2，虉草單播量15 kg/hm2?；觳ソM分中苜蓿播種量分別占單播量的50%(B1)、50%(B2)、33%(B3)和67%(B4)；禾草播種量分別占單播量的50%(B1)、50%(B2)、67%(B3)和33%(B4)。采用隨機區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積5 m×4 m，行距30 cm，每小區(qū)12行，3次重復(fù)。

1.3 測定項目與方法

播種當(dāng)年于8月3日在苜蓿盛花期進行第1次刈割，留茬5 cm。9月10日對再生草分種取樣，選取頂部往下數(shù)第3～4片無損壞葉片10 g，在液氮中迅速冷凍，帶回實驗室后，存放冰柜中保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化?SOD)活性采用NBT光還原法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮法測定[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，用DPS 17.10進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 混播禾草種類對混播植物抗氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 混播禾草種類對混播植物SOD活性的影響 不同禾草葉片SOD活性差異明顯。虉草(A3)葉中SOD含量最高，分別比無芒雀麥(A1)和披堿草(A2)高29.94%和20.69%(P<0.01)，其次是貓尾草(A4)，分別比無芒雀麥(A1)和披堿草(A2)高出21.83%和13.16%(P<0.01)；A3和A4以及A2和A1處理禾草SOD活性差異不顯著(P>0.05)。A4和A3處理苜蓿SOD活性分別比A2處理高12.37%和13.68%(P<0.05)，其余處理間苜蓿SOD活性沒有顯著差異(表1，2)。

2.1.2 混播禾草種類對混播植物POD活性的影響 A2處理禾草POD活性最高，其次是A3處理。其中，A2處理禾草POD活性分別比A1，A3和A4處理高250.04%，20.22%和350.42%倍，差異均達極顯著水平(P<0.01)；A3處理禾草POD活性分別比A1和A4處理高191.18%和274.68%(P<0.01)。A1和A4處理之間差異不顯著(表1)。A1處理下苜蓿POD活性比A4處理高19.47%(P<0.01)；A3處理POD活性比A4處理高16.40%(P<0.05)；其余處理之間無顯著差異。

2.1.3 混播禾草種類對混播植物MDA含量的影響 A3、A4處理禾草MDA含量極顯著(P<0.01)低于A1和A2處理，其中,A3處理低50.35%和51.53%，A4處理低67.29%和68.06%；A4處理禾草MDA含量又極顯著低于A3處理(P<0.01)；A2和A1處理之間沒有顯著性差異。不同禾草種類處理對苜蓿葉片中MDA含量沒有顯著影響(表1，2)。

表1 混播禾草種類處理下禾草葉片的抗氧化特性Table 1 The effects of mixed sowing grass species on the antioxidant properties of grasses

注：同列不同大寫字母表示不同混播組合產(chǎn)量差異極顯著(P<0.01),同列不同小寫字母表示不同混播組合產(chǎn)量差異顯著(P<0.05),下同

表2 混播禾草種類處理下苜蓿葉片的抗氧化特性Table 2 The effects of mixed sowing grass species on the antioxidantproperties of alfalfa

2.1.4 混播禾草種類對混播植物Pro含量的影響 A3處理禾草Pro含量最高，分別比A1，A2和A4處理高79.59%，28.78%和95.56%，差異均達極顯著水平(P<0.01)，其中A2處理禾草Pro含量比A1和A4處理高39.46%和51.85%(P<0.01)；A1和A4處理禾草Pro含量沒有顯著差異(表1)。苜蓿與不同禾草混播后，A1處理苜蓿葉中Pro含量最高，分別比A2，A3和A4處理高17.76%，8.16%和24.89%，與A4處理差異極顯著(P<0.01)，與A2處理差異顯著(P<0.05)，A1和A3處理之間差異不顯著，A2，A3和A4處理之間差異不顯著(表2)。

2.2 混播比例對混播植物抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1 混播比例對混播植物SOD活性的影響 B4處理禾草SOD活性最低，比B1，B2和B3處理低11.81%、11.38%(P<0.05)和8.62%(P>0.05)，其他各處理之間無顯著差異。單播苜蓿SOD活性最低，其次是B4處理，單播苜蓿分別比B1，B2和B3處理苜蓿SOD活性低20.91%，22.80%和21.58%，差異均達極顯著水平(P<0.01)；B4處理分別比B1，B2和B3處理低13.32%、15.38%和14.05%(P<0.05)，其余處理間苜蓿SOD活性差異不顯著(表3，4)。

2.2.2 混播比例對混播植物POD活性的影響 B1和B2處理禾草POD活性極顯著(P<0.01)高于B3和B4

處理，顯著(P<0.05)高于單播處理。B1與B2處理以及B3與B4處理之間禾草POD活性沒有顯著差異(表3)。B4處理禾草POD活性分別比B1、B2和B3處理低31.79%，30.58%和3.35%(P>0.01)。B1處理苜蓿POD活性最高，分別比B2，B3、B4和單播苜蓿處理高19.18%、21.45%、35.39%和31.79%，差異極顯著(P<0.01)。B4處理禾草POD活性分別比B1，B2和B3處理低26.14%，11.98%和10.30%(P>0.05)，其余混播比例下苜蓿POD活性均無顯著差異(表4)。

2.2.3 混播比例對混播植物MDA含量的影響 單播禾草MDA含量最高，分別比B1、B2、B3和B4處理高27.86%、44.35%、66.40%和46.42%，與B3處理差異極顯著(P<0.01)，與其他處理差異顯著(P<0.05)。B2處理禾草MDA含量比B3處理高30.14%(P<0.05)，其余處理間差異不顯著(表3)。除B1處理苜蓿MDA含量顯著(P<0.05)高于B3和B4處理外，其余處理苜蓿MDA含量均無顯著差異(表4)。

2.2.4 混播比例對混播植物Pro含量的影響 不同混播比例對禾草Pro含量均無顯著影響(表3)，而對苜蓿Pro含量有明顯影響(表4)。B1處理Pro含量最高，比B2，B3和B4處理高24.48%，27.41%和49.50%，差異極顯著(P<0.01)；單播苜蓿苜蓿Pro含量分別比B3和B4處理高17.77%(P<0.05)和38.19%(P<0.01)，B2處理Pro含量比B4處理高20.10%(P<0.05)，其余處理間苜蓿Pro含量無顯著差異(P>0.05)。

表3 混播比例處理下禾草葉片的抗氧化特性Table 3 The effects of mixed sowing ratios on the antioxidant properties of grass

表4 混播比例處理下苜蓿葉片的抗氧化特性Table 4 The effects of mixed sowing ratios on the antioxidant properties of alfalfa

苜蓿與禾草2∶1混播禾草的抗氧化酶(SOD、POD)活性最低。單播苜蓿和2∶1混播苜蓿具有較低的抗氧化酶活性。

2.3 混播組合對混播植物抗氧化系統(tǒng)的影響

2.3.1 混播組合對混播植物SOD活性的影響 混播組合對禾草SOD活性影響明顯(表5)。20個不同混播組合，A3B1組合禾草SOD活性最高，達到304.21 U/g，顯著高于A1B0、A1B4、A2B1、A2B2、A2B3、A2B4組合(P<0.05)。不同混播比例下虉草的SOD活性明顯高于披堿草?；觳ソM合對苜蓿SOD活性的影響沒有禾草明顯(表6)。除A4B1組合苜蓿SOD活性顯著高于A2B4組合和單播苜蓿外，其余組合苜蓿SOD活性沒有顯著差異(表5)。

表5 混播組合處理下禾草葉片的抗氧化特性Table 5 The effects of mixed sowing combinations on the antioxidant properties of grass

注：B0表示苜蓿播種量為零，是單播禾草

2.3.2 混播組合對混播植物POD活性的影響 在不同混播組合條件下，A2B1組合禾草體內(nèi)POD活性最高(表5)，達到276.07 U/(g·min)，顯著高于A2B2組合之外的其他混播組合(P<0.05)。貓尾草不同混播比例組合POD活性普遍比較低，在29.13～74.54 U/(g·min)，而披堿草不同混播比例組合POD活性普遍較高，為156.21～276.07 U/(g·min)，顯著高于貓尾草組合(P<0.05)。苜蓿POD活性以A3B1組合最高(表6)，達到383.09 U/(g·min)，與其他處理組合(A1B1除外)間差異均達顯著水平(P<0.05)。A2B4組合苜蓿POD活性最低，僅為 187.24 U/(g·min)，顯著低于A1B1、A1B2、A1B3、A1B4、A2B1、A2B2、A2B3和A3B1組合(P<0.05)。

2.3.3 混播組合對混播植物MDA含量的影響 A2B0和A1B0組合禾草MDA含量顯著高于其他組合(P<0.05)。貓尾草不同混播比例組合MDA含量普遍較低，為1.77～4.36 μmol/g(表5)，而披堿草為5.65～12.84 μmol/g，無芒雀麥為6.69～12.83 μmol/g，除A2B3外，其余組合均顯著高于貓尾草組合(P<0.05)。在不同混播組合條件下，苜蓿MDA含量最高的組合是A2B1,顯著高于A3B2，A3B3和A1B4組合(P<0.05)，其余混播組合間苜蓿MDA含量差異不顯著(表6)。

2.3.4 混播組合對混播植物Pro含量的影響 不同混播組合處理下，禾草Pro含量以A3B3組合最高，其次是A3B0，A1B3組合Pro含量最低，其中A3B3組合與其他組合(A3B0，A2B1和A3B4除外)間差異均達顯著水平(P<0.05)，A3B0，A2B1和A3B4組合顯著高于A1B1，A1B3和A2B4以及貓尾草的不同混播比例組合(P<0.05)。苜蓿Pro含量最高的混播組合為A1B1組合，其次是A1B2組合，與其他組合(A3B1除外)間差異均達顯著水平(P<0.05)。

表6 混播組合處理下苜蓿的抗氧化特性Table 6 The effects of mixed sowing combinations on the antioxidant properties of alfalfa

3 討論

在苜蓿與禾草混播組合中既存在種間對養(yǎng)分、水分及空間資源的競爭，也存在光資源競爭。在二茬草生長時期，苜蓿再生速度明顯強于禾草，同時期苜蓿株高也明顯高于禾草，因此，苜蓿會對禾草產(chǎn)生遮蔭脅迫。在不同混播禾草種類和混播比例下，混播草地植物所受到的逆境脅迫程度也不盡相同。而在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧數(shù)量劇增，作為應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化酶活性和抗氧化劑含量會迅速升高，以清除氧自由基，維持細胞內(nèi)氧自由基的平衡[17]。SOD和POD是清除超氧自由基和過氧化氫，阻止或是減輕羥基自由基對植株生物膜破壞的主要酶，MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映膜脂過氧化程度和植物對逆境抗性的強弱[18]，當(dāng)細胞遭受逆境脅迫時，細胞膜發(fā)生氧化分解，MDA大量積累，其含量越高表明植物抗逆境能力越差[19]。

有研究表明，在遮蔭脅迫下高羊茅抗氧化酶活性會呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢[20]，隨遮蔭度增加，金蓮花SOD 活性持續(xù)下降[21]。也有學(xué)者認為，不同生育期遮蔭對植物葉片SOD、POD活性和MDA含量影響程度不同，抽穗期遮蔭過程中，谷子植株表現(xiàn)出一定的自我調(diào)節(jié)能力，低遮蔭密度條件下，SOD、POD活性升高，MDA含量降低[22]。試驗中混播條件下虉草具有較高的SOD、POD活性和Pro含量，而MDA含量較低，表明其抗逆性或受種間競爭脅迫影響小于其余3種禾草。在苜蓿-虉草混播草地苜蓿也具有較高的SOD、POD活性和Pro含量，而MDA含量較低，表明苜蓿-虉草混播草地在播種當(dāng)年種間干擾相對較小，受競爭脅迫影響不明顯。豆禾混播比例顯著影響禾草SOD、POD活性。豆禾2∶1混播顯著降低了禾草的SOD、POD活性，這是因為豆禾2∶1混播草地苜蓿對禾草的競爭脅迫程度明顯大于其他混播比例，尤其是對禾草的遮蔭脅迫程度大于其余混播草地。在豆禾2∶1混播草地混播苜蓿的SOD、POD活性和MDA含量、Pro含量均最低，這可能是苜蓿種內(nèi)競爭脅迫所致，因為豆禾2∶1混播草地混播苜蓿的種群密度明顯大于豆禾1∶1、2∶2和1∶2混播。苜蓿-禾草2∶2混播時，禾草和苜蓿具有較高的SOD和POD活性及較低的MDA含量。這是因為植物SOD和POD 活性的變化順序和增長幅度受植物抗性、植物種類、脅迫強度等諸多因素的影響[23]。在苜蓿-禾草混播群落，禾草會受到苜蓿遮蔭脅迫。遮蔭可誘導(dǎo)植物SOD、POD活性下降，膜脂過氧化程度加劇，MDA含量升高。

在混播群落中，除存在遮蔭脅迫外，還存在種間資源競爭脅迫，而不同植物種類對種間競爭脅迫的響應(yīng)不同。馬嬌等[25]研究發(fā)現(xiàn)，高羊茅、草地早熟禾和多年生黑麥草混播草坪草對絲茅入侵的生理響應(yīng)存在顯著的種間差異，絲茅密度越大對草坪草傷害越大，本試驗與馬嬌等[25]、呂晉慧等[23]報道結(jié)論相似。苜蓿-無芒雀麥、苜蓿-虉草2∶2混播，禾草與苜蓿均具有較高的SOD、POD活性和較低的MDA含量，表明這兩種混播草地禾草與苜蓿受種間競爭脅迫傷害相對較小。

4 結(jié)論

苜蓿與4種禾草混播群落中，混播虉草的抗氧化能力大于其他3種禾草，苜蓿的抗氧化能力在苜蓿-貓尾草混播群落中大于其他3種混播群落。

豆禾2∶1混播顯著降低了禾草的SOD和POD活性，禾草受種間競爭脅迫影響較大。2∶2混播時，禾草和苜蓿均具有較高的SOD和POD活性，禾草生長良好，受種間競爭脅迫傷害相對較小。