臂叢各神經(jīng)根切斷后靶肌肉內(nèi)代償機制的實驗研究

姜宗圓 熊章霞 歐陽陽剛 孫浩然 梁海 陳琪 劉岸雄 謝統(tǒng)明

30多年來，健側(cè)頸7移位術(shù)已成為治療全臂叢根性撕脫傷的主要術(shù)式[1-5]。在對健側(cè)頸7神經(jīng)根切斷后代償機制的研究中，我們發(fā)現(xiàn)：頸7神經(jīng)根支配的運動單位在某些靶肌肉內(nèi)可能分布不均勻，來源于鄰近健康神經(jīng)的軸突出芽可能是頸7神經(jīng)根切斷術(shù)重要的代償方式[6-8]。那么，臂叢各神經(jīng)根切斷后鄰近健康神經(jīng)的軸突出芽是否也可實現(xiàn)代償，即臂叢各神經(jīng)根是否同樣存在神經(jīng)根移位術(shù)的可能？

因此，本研究采用臂叢頸5至胸1各神經(jīng)根單獨切斷的SD大鼠模型，運用乙酰膽堿酯酶染色和單纖維肌電圖（Single-fiber electromyography，SFEMG）檢測，研究臂叢神經(jīng)各根切斷后主要靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的變化過程，探索臂叢神經(jīng)各根在靶肌肉內(nèi)分布特點和切斷后的代償機制。

1 材料和方法

1.1 臂叢各神經(jīng)根切斷的動物模型制作

120只雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g。隨機分為5組，每組24只。腹腔內(nèi)注射麻醉后，手術(shù)顯微鏡下在SD大鼠右側(cè)鎖骨下區(qū)作切口，將臂叢神經(jīng)根部結(jié)構(gòu)完整顯露。將右側(cè)頸5神經(jīng)根用1%利多卡因局封后切斷，遠側(cè)端向遠端翻起并用10-0無創(chuàng)傷縫線固定于胸小肌膜上，造成右側(cè)頸5神經(jīng)根至少4 cm以上缺損的頸5神經(jīng)根切斷組模型。左側(cè)頸5神經(jīng)根顯露后不作處理，為對照組。同理，分別制成頸6、頸7、頸8和胸1神經(jīng)根切斷組。關(guān)閉切口，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)動物。

1.2 單纖維肌電圖檢測

在臂叢各神經(jīng)根切斷術(shù)后第1、4、8、12周，沿原右側(cè)鎖骨下區(qū)的切口進入，分離到臂叢神經(jīng)根部位置，確認臂叢各神經(jīng)根仍然斷裂，如有再生神經(jīng)纖維連接，則該動物棄用。顯露各神經(jīng)根主要靶肌肉（頸5對應(yīng)三角肌、大圓肌，頸6對應(yīng)肱二頭肌、肱橈肌，頸7對應(yīng)背闊肌、肱三頭肌，頸7對應(yīng)屈指肌、尺側(cè)屈腕肌，胸1則對應(yīng)爪內(nèi)骨骼肌）起止點，分離清楚神經(jīng)入肌點備用。

肌電圖儀為KEYPOINT全功能肌電圖儀，陰性電極為刺激電極，放在距靶肌肉起點1 cm處，陽性電極置于距陰性電極遠側(cè)0.5 cm處，開始脈沖刺激10 Hz，刺激時限為 50 μs，1～4 mA 電流。 刺激電流每0.1 mA逐步增加，直到局部肌肉出現(xiàn)細小的抽搐。記錄的單纖維電極在距離陰性電極遠側(cè)2 cm處插入肌肉內(nèi)，慢慢調(diào)整深淺、細心旋轉(zhuǎn)針頭，直至獲得穩(wěn)定的、滿意的肌肉動作電位。SFAP的確認是獲得雙相波形，峰-峰波幅大于200 μV，負峰上升時間少于 200～300 μs，全部持續(xù)時間少于 1 ms，波形穩(wěn)定而不被其他電位干擾[9]。刺激電流在閾刺激強度上增加10%作為標(biāo)準(zhǔn)刺激強度。對照組進行同樣的SFMEG檢測。

在每個位點計算機記錄100個連續(xù)放電沖動下，從每塊肌肉的20個不同記錄位點值中計算得出平均Jitter值，并自動計算出MCD（Mean consecutive difference of their latencies）、MSD （Mean sorted difference）和 MIPI（Mean interpotential interval）值。

1.3 組織標(biāo)本的采集及處理

完成SFMEG檢測后，迅速切取各靶肌肉，置于4%多聚甲醛中4℃固定24 h，PBS洗數(shù)次，OTC包埋，在異戊烷里速凍片刻后封存，縱形連續(xù)冰凍切片（15 μm），-80 ℃冰箱保存。

1.4 乙酰膽堿酯酶染色及灰階度測定

乙酰膽堿酯酶染色：配制Karnovsky-Roots孵育液（碘化乙酰硫代膽堿13 mg，0.1 mol/L磷酸二氫鈉7 mL，0.1 mol/L磷酸氫二鈉9 mL，0.1 mol/L檸檬酸鈉1 mL，50 mmol/L硫酸銅 3 mL，蒸餾水 2 mL）后，加入至15 μm冰凍切片，室溫下放置24 h，蒸餾水洗數(shù)次，脫水，封固。

乙酰膽堿酯酶灰階度測定：應(yīng)用Qwin圖像分析系統(tǒng)，測定各組靶肌內(nèi)終板區(qū)乙酰膽堿酯酶含量。每塊肌肉的染色切片中隨機取3張，200倍光鏡下隨機觀察10個運動終板，檢測乙酰膽堿酯酶染色的縱斷面大小和切片酶的灰階度值。為了合理減少工作量，于每組中隨機取2只動物的對照側(cè)樣本進行檢測，最后共8只實驗動物的對照側(cè)數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

用 SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，以（x±s）表示，對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊者用配對t檢驗，方差不齊者用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單纖維肌電圖檢測

在第 1、4、8、12 周，臂叢各神經(jīng)根切斷組（包括正常對照側(cè)）的靶肌肉接受SFMEG檢測，計算機記錄靶肌肉中成功測出的有Jitter的SFAP圖形，收集每側(cè)靶肌肉所有測出的Jitter值，自動計算MCD、MIPI值和MCD分布圖。

在臂叢神經(jīng)各根切斷組中，頸5和胸1神經(jīng)根切斷后在靶肌肉內(nèi)出現(xiàn)無代償特征的Jitter圖形（圖1）；頸6、頸7和頸8神經(jīng)根切斷后會出現(xiàn)明顯的代償性Jitter改變（圖2）。結(jié)果表明，在臂叢神經(jīng)各根切斷組中，僅頸7神經(jīng)根切斷后第1～4周時Jitter均值逐漸增大，且明顯高于對照組（P＜0.05），第8～12后恢復(fù)正常（圖3）。其余各神經(jīng)根切斷后的Jitter均值明顯低于對照組（P＜0.05）。臂叢神經(jīng)各根切斷后靶肌肉內(nèi)的MCD的分布圖表明，僅在頸7神經(jīng)根切斷后會出現(xiàn)明顯代償變化（圖4）。

2.2 乙酰膽堿酯酶染色

正常肌肉內(nèi)運動終板呈橢圓形，大小基本一致，外圍有黃褐色環(huán)帶，內(nèi)圈呈棕黃染色，邊緣清晰銳利，著色均勻。

頸5神經(jīng)根切斷術(shù)后第1周，靶肌肉運動終板的大小、形態(tài)和染色深淺并無改變，第4周開始運動終板面積逐漸擴大，乙酰膽堿酯酶染色變深，范圍不變或縮小，到第8～12周，運動終板染色變淡，消失（圖 5-6）。

頸6神經(jīng)根切斷術(shù)后第4周，運動終板面積散大，變形，乙酰膽堿酯酶染色變淺，到第8～12周，大部分運動終板消失，但仍有部分面積擴大，淡染的運動終板存在（圖7）。

頸7神經(jīng)根切斷術(shù)后第4～8周，在某些區(qū)域能發(fā)現(xiàn)少數(shù)異常的運動終板，表現(xiàn)為面積擴大，扭曲變形，乙酰膽堿酯酶染色變淺，到第12周后，運動終板的大小、形態(tài)和染色深淺全部恢復(fù)正常（圖8）。

頸8神經(jīng)根切斷術(shù)后靶肌肉內(nèi)運動終板變化與頸6神經(jīng)根切斷術(shù)幾乎一致，但可見少數(shù)恢復(fù)正常形態(tài)的運動終板（圖9）。

胸1神經(jīng)根切斷術(shù)后，靶肌肉運動終板在4～12周內(nèi)同樣存在從散大、變淡直至消失的過程（圖10）。

對每塊肌肉內(nèi)平均運動終板大小（表1）和乙酰膽堿酯酶染色的灰階度值進行半定量統(tǒng)計 （表2），發(fā)現(xiàn)各神經(jīng)根切斷組和對照組在術(shù)后1～8周內(nèi)，組別間平均運動終板大小和平均乙酰膽堿酯酶灰階度差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），僅術(shù)后第12周時，頸5、6、8、胸1切斷組的運動終板面積增大，乙酰膽堿酯酶灰階度下降，與其他時間段有明顯差異（P＜0.05），而頸7切斷組卻能基本恢復(fù)到對照組水平。

圖1 頸神經(jīng)根切斷后無代償特征的jitter圖形Fig.1 Jitter pattern with no compensatory feature after cervical nerve root amputation

圖2 頸神經(jīng)根切斷后有代償特征的jitter圖形Fig.2 Jitter pattern with compensatory characteristics after cervical nerve root amputation

圖3 不同時間段實驗組與對照組間Jitter均值比較（紅色為對照組，藍色為實驗組）Fig.3 Comparison of Jitter mean values between experimental and control groups in different time periods（Red:CG;Blue:EG）

圖4 第1～12周內(nèi)的具代表性MCD（即Jitter均值）分布圖Fig.4 Representative MCD (Jitter mean values)distribution map in 1-12 weeks

圖5 C5神經(jīng)根切斷后第1～4周內(nèi)，靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)變化Fig.5 The shape of motor endplate in target muscle 1-4 weeks after C5 nerve root amputation

圖6 C5神經(jīng)根切斷后第8～12周內(nèi)，靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)變化Fig.6 The shape of motor endplate in target muscle 8-12 weeks after C5 nerve root amputation

圖7 C6神經(jīng)根切斷后靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)變化Fig.7 Morphologic changes of motor endplate in target muscle after C6 nerve root amputation

圖8 C7神經(jīng)根切斷后靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)變化Fig.8 Morphologic changes of motor endplate in target muscle after C7 nerve root amputation

圖9 C8神經(jīng)根切斷后靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)變化Fig.9 Morphologic changes of motor endplate in target muscle after C8 nerve root amputation

圖10 T1神經(jīng)根切斷后靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)變化Fig.10 Morphologic changes of motor endplate in target muscle after T1 nerve root amputation

表1 各神經(jīng)根切斷后不同時間點靶肌肉內(nèi)運動終板面積比較Table 1 Comparison of motor endplate area in target muscle at different time points after amputation of nerve root

表2 各神經(jīng)根切斷后不同時間點靶肌肉內(nèi)乙酰膽堿酯酶灰階度比較Table 2 Comparison of the gray-scale of acetylcholinesterase in target muscle at different time points after nerve root amputation

3 討論

3.1 臂叢各神經(jīng)根切斷術(shù)后的運動終板功能變化

SFMEG具有微創(chuàng)性，操作簡便，能提供更多有關(guān)運動單位信息，結(jié)果穩(wěn)定可靠的Jitter值是評價神經(jīng)－肌肉接頭功能的敏感指標(biāo)[10-11]。因此，我們應(yīng)用SFMEG檢測來研究臂叢各神經(jīng)根切斷后其支配肌內(nèi)的運動終板功能的代償過程[9，12]。

頸5神經(jīng)根切斷后1周，三角肌和大圓肌內(nèi)運動終板功能明顯下降，直至第12周時靶肌肉內(nèi)都很難檢測到代償性Jitter改變。這說明頸5神經(jīng)根切斷后，其支配肌內(nèi)臨近的健康神經(jīng)纖維代償能力缺乏，無法改變肌肉內(nèi)的失神經(jīng)性退變過程。

頸6神經(jīng)根切斷后的靶肌肉內(nèi)，盡管在第4～8周檢測出少許運動終板有代償性Jitter出現(xiàn)，但代償性的軸突出芽[6]很少發(fā)生，整個實驗周期內(nèi)靶肌肉內(nèi)的運動終板功能下降，未檢測到恢復(fù)跡象。說明健側(cè)頸6神經(jīng)根切斷后的代償能力低下。

頸7神經(jīng)根切斷后的肱三頭肌和背闊肌內(nèi)，術(shù)后1周靶肌肉內(nèi)出現(xiàn)大量的代償性Jitter改變，頸7神經(jīng)根切斷后第4周，Jitter值逐漸增大，第1～4周內(nèi)的Jitter值明顯高于對照組，說明頸7神經(jīng)根切斷后早期出現(xiàn)非?；钴S的代償改變，第8～12周后，Jitter值恢復(fù)至正常水平，運動終板功能得到代償。

頸8神經(jīng)根切斷后第1～4周內(nèi)，屈指肌和尺側(cè)屈腕肌內(nèi)僅個別部位能測到代償性Jitter改變，第8～12周時出現(xiàn)Jitter值增大，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異，即運動終板功能未獲得有效代償。

胸1神經(jīng)根切斷后，靶肌肉內(nèi)Jitter改變與頸5神經(jīng)根基本相同。

而對于MCD（即Jitter均值）的差異性來說，由于代償時出芽致同一軸突再支配肌纖維數(shù)量增加，興奮由軸突末梢共同分支點至各纖維傳導(dǎo)時間不同，致使MCD增加[13]的特征僅在頸7神經(jīng)根切斷后明顯出現(xiàn)，頸8神經(jīng)根切斷也部分出現(xiàn)，其余神經(jīng)根切斷后幾乎沒有。

3.2 臂叢各神經(jīng)根切斷術(shù)后靶肌肉內(nèi)運動終板的形態(tài)學(xué)變化

運動終板以直徑25～30 μm的梅花形分布于肌纖維表面[14-15]，周圍神經(jīng)損傷后運動終板消失[16-17]，神經(jīng)再生時，運動終板結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常[18]。早期研究中，我們發(fā)現(xiàn)頸7神經(jīng)根切斷后第4～8周，靶肌肉內(nèi)大部分運動終板的大小、終板區(qū)乙酰膽堿酯酶灰階度有消褪趨勢，但第8周時開始逐步恢復(fù)，術(shù)后第12周，由于臨近健康神經(jīng)的軸突出芽，基本恢復(fù)了運動終板結(jié)構(gòu)的正常形態(tài)[7]，從而證明健側(cè)頸7神經(jīng)根具有進行移位術(shù)的理論基礎(chǔ)。

在頸5神經(jīng)根切斷術(shù)后1周，三角肌和大圓肌內(nèi)運動終板面積大小和乙酰膽堿酯酶灰階度無明顯變化；4～12周時，絕大部分運動終板逐漸散大，乙酰膽堿酯酶灰階度變淡，逐漸消失。頸5神經(jīng)根切斷后，其主要支配的肌肱二頭肌和肱橈肌內(nèi)的運動終板形態(tài)變化，表現(xiàn)出不可代償性。這與臨床上頸5神經(jīng)根斷裂后出現(xiàn)肩關(guān)節(jié)外展功能障礙符合[5]。

頸6神經(jīng)根切斷后4～12周，肱二頭肌和肱橈肌內(nèi)的運動終板逐漸散大，乙酰膽堿酯酶灰階度變淡，其趨勢同頸5神經(jīng)根切斷后。12周后，也僅能看到少許不均勻分布的正常形態(tài)的運動終板。說明健側(cè)頸6神經(jīng)根切斷后基本不具備代償能力。

頸7神經(jīng)根切斷后靶肌肉內(nèi)運動終板的形態(tài)變化與我們以前的研究結(jié)果相同，且在相同實驗條件下，其代償能力與其他神經(jīng)根形成很好的對比。

頸8神經(jīng)根切斷后4～8周，屈指肌和尺側(cè)屈腕肌內(nèi)的運動終板逐漸散大，乙酰膽堿酯酶灰階度變淡。12周后，運動終板大部分繼續(xù)散大、變淡直至消失，但仍有部分區(qū)域能看到運動終板的維持。證明在大鼠實驗中健側(cè)頸8神經(jīng)根也具備部分代償能力，存在健側(cè)神經(jīng)根移位術(shù)的可能性。

胸1神經(jīng)根切斷后，爪內(nèi)骨骼肌的運動終板形態(tài)變化的趨勢同頸5神經(jīng)根切斷后。

3.3 本研究的意義

盡管頸7神經(jīng)包含有17 000至40 000根神經(jīng)纖維，但僅以此來修復(fù)全臂叢神經(jīng)仍顯不足[19-20]；而且，健側(cè)頸7移位術(shù)存在健肢同步收縮問題，即患側(cè)修復(fù)神經(jīng)的功能需要健側(cè)肌肉收縮而激發(fā)，使患側(cè)功能的獨立行使受到影響。

如能從健側(cè)找出更多的動力神經(jīng)來同時修復(fù)上干和下干，或?qū)@得更為理想的效果。以往研究認為，頸7神經(jīng)根單獨成中干，其在臂叢神經(jīng)中特殊的結(jié)構(gòu)是頸7神經(jīng)根移位術(shù)的理論基礎(chǔ)。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，頸7神經(jīng)根支配的運動單位在某些靶肌肉內(nèi)可能分布不均勻，來源于鄰近健康神經(jīng)的軸突出芽是頸7神經(jīng)根切斷術(shù)重要的代償方式[6-8]。那么，頸6或頸8神經(jīng)根切斷后鄰近健康神經(jīng)的軸突出芽也可能實現(xiàn)代償，也就是說頸6和頸8神經(jīng)根也可能具備神經(jīng)根移位術(shù)的潛力。

為了研究頸6和頸8神經(jīng)根的代償潛力，我們對所有臂叢神經(jīng)根的分布和切斷后的代償能力進行了以SD大鼠為動物模型的實驗研究。結(jié)合靶肌肉內(nèi)運動終板形態(tài)和功能的變化過程，我們認為頸5、胸1神經(jīng)根不具有代償潛力，不能切斷作為供區(qū)神經(jīng)；盡管頸6神經(jīng)根和頸8神經(jīng)根切斷后均有代償潛力，且兩者在統(tǒng)計學(xué)上差異不大，但頸6神經(jīng)根切斷后的肌肉冰凍切片中觀察到大部分靶肌肉會出現(xiàn)不可逆性退變。另外，我們在臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，頸6神經(jīng)根損傷患者出現(xiàn)明確的屈肘癱瘓現(xiàn)象，建議切斷頸6神經(jīng)根作為供區(qū)神經(jīng)的選擇要慎重；頸8神經(jīng)根在SD大鼠實驗中表現(xiàn)出有限的代償潛力，需要進一步研究。當(dāng)然，頸7神經(jīng)根具有完美的代償潛力，已在實驗和臨床上都得到了很好的驗證。

將來，健側(cè)多根神經(jīng)根移位術(shù)的設(shè)計可能要考慮頸7和頸8神經(jīng)根，或選擇頸6部分神經(jīng)根和頸8部分或全部神經(jīng)根的組合。今后，我們將針對這樣的實驗方案進行更為深入的研究。