趨磁細菌磁小體及其相關MRI報告基因分子影像學研究

張薇薇，Donna E. Goldhawk，李海龍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學影像教研室，4.臨床診斷檢驗教研室，5.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉化重點實驗室,甘肅 蘭州 730000；2.羅森健康研究所醫(yī)學影像項目組，安大略 倫敦 N6A 5C1；3.西安大略大學醫(yī)學生物物理學系，安大略 倫敦 N6A 4V2)

報告基因指在細胞、組織或器官處于特定情況下編碼可被檢測的蛋白質或酶的一類基因，其表達產物易于檢測。這一概念起源于20世紀80年代[1]，而將報告基因與MRI結合起來的研究可追溯至20世紀90年代[2]。最早的受體靶向MRI對比劑采用轉鐵蛋白受體(transferrin receptor， TfR)，之后Weissleder等[3]提出利用MRI監(jiān)測體內轉基因表達信息技術，使得MRI報告基因的研究越來越受到關注。磁小體由趨磁細菌經過生物礦化而形成，是1種由基因調控而成的磁性納米顆粒，受生長環(huán)境影響，其核心成分主要是磁鐵礦(Fe3O4)或膠黃鐵礦(Fe3S4)；與人工合成的磁性Fe3O4納米顆粒相比，其最大特點是自帶天然形成的磷脂雙層生物膜結構。磁小體具有穩(wěn)定的單磁疇結構、室溫下永久磁性、化學純度高、粒徑均一、晶體形態(tài)一致等特點。此外，磁小體的合成由1組特定基因控制[4]。以上諸多特性使磁小體顯示出巨大的醫(yī)學應用和商業(yè)化潛力。本文從MRI報告基因應用角度，對磁小體及其相關基因作為新型生物材料在分子影像學方面的研究進行綜述。

1 磁小體的分子影像學應用

目前已在數種細胞模型中證實了磁小體的潛在MR對比劑用途，包括胰腺細胞[5]、腦細胞[6]及異種移植腫瘤細胞[7]，相關研究正在引起極大關注。

1.1 磁小體在腫瘤靶向MRI中的應用 有學者[7]運用組合化學(one-bead-one-compound， OBOC)技術，成功篩選出靶向表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor， EGFR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2， HER2)的新肽P75，該肽可對自野生型趨磁細菌MSR-1菌株中提取的磁小體進行表面修飾，形成Mag-P75，用于腫瘤靶向MR成像；體外和體內熒光成像結果表明，Mag-P75可特異性結合人乳腺癌細胞MDA-MB-468，在腫瘤模型內顯示出明顯負對比增強，提示Mag-P75在MR靶向診斷EGFR和HER2陽性腫瘤中具有較高敏感度，可以作為T2加權對比劑。此外，該研究[7]還發(fā)現(xiàn)肽功能化磁小體具有診斷、治療和監(jiān)測腫瘤的多功能納米粒子的潛力。Alphandéry等[8]使用磁小體鏈，在交變磁場作用下對小鼠顱內U87-Luc膠質瘤行磁熱療，導致病灶完全消失，表明在交變磁場作用下，從磁小體鏈中釋放內毒素的量可控制，提示此為導致腫瘤破壞的機制之一。Erdal等[9]對磁小體與超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide， SPIO)靶向乳腺癌MDA-MB-231細胞的比較研究顯示，人血清白蛋白(human serum albumin， HSA)包被的SPIO(HSA-SPIONs)與磁小體均可與熒光標記的抗EGFR抗體化學綴合。濃度為250 μg/ml的磁小體與MDA-MB-231細胞的結合率為92.0%±0.2%，而250 μg/ml的HSA-SPIONs顆粒結合率則為65.0%±5.0%；在腫瘤組織中，抗EGFR修飾后的磁小體比HSA-SPIONs顆粒具有更高的T2WI信號。此外，利用磁共生體(magneto-endosymbionts， MEs)技術，已經推出了商業(yè)化的細胞標記試劑盒，被用作基于磁鐵礦的MRI對比劑來示蹤細胞，其增強T2、T2*對比度的作用在體內更具優(yōu)勢[10]。

1.2 磁小體在磁性粒子成像(magnetic particle imaging， MPI)中的應用 極低劑量的磁小體即可被高磁場MR探測出，磁小體的高敏感度使其在對比劑領域有廣闊的應用前景。Kraupner等[11]將磁小體作為磁性示蹤材料用于MPI，并與商用示蹤劑Resovist?的分辨率進行比較，結果表明磁小體明顯優(yōu)于后者。在17.2T磁場下，Mériaux等[12]比較趨磁細菌MV-1、AMB-1菌株中提取的磁小體與已商業(yè)化的MRI對比劑Ferumoxide的弛豫率，發(fā)現(xiàn)2種磁小體的橫向弛豫率均高于Ferumoxide，而由MV-1提取的磁小體的橫向弛豫率最高，約為Ferumoxide的4倍；筆者隨后分別將100 μl生理血清、Ferumoxide及MV-1中提取的純化磁小體注入小鼠腦血管并進行三維血管造影成像，發(fā)現(xiàn)MV-1磁小體使檢測到的體素信號提高約20%。

雖然用普通培養(yǎng)方法生成的磁小體產量有限，磁小體的分離、純化成本較高，但不斷改進方法[13]后，這些問題逐漸得到改善。基于磁小體天然包膜的存在，目前普遍認為利用各種化學手段、蛋白融合技術修飾磁小體表面具有可行性，對于磁小體體外仿生[4]、磁小體在腫瘤診斷、磁熱療及調控腫瘤微環(huán)境乃至制備腫瘤靶向藥物遞送系統(tǒng)的研究將會進一步深入。

2 磁小體相關基因在MRI報告基因中的應用

2.1 磁小體生物礦化相關基因 對趨磁細菌AMB-1和MSR-1的系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)磁小體生物礦化包括4個步驟[14]：①磁小體膜(magnetosome membrane，mam)從細胞質膜內陷，形成囊泡樣永久內陷或分離的囊泡；②在內陷前或后，磁小體蛋白被分選到mam；③鐵被轉移到磁小體囊泡中，并被礦化為磁鐵礦晶體；④組裝并定位磁小體鏈，以在細胞分裂期間分離。迄今已有50多種編碼磁小體相關蛋白的基因通過鑒定[14]。磁小體生物礦化特定功能均與1組約30個聚集在單個染色體區(qū)域的基因有關，稱之為基因組磁小體島(magnetosome island， MAI)，包含mam基因和磁性粒子-膜特異性(magnetic particle-membrane specific， mms)基因。有研究[15]將mam、mms等相關基因用于MRI報告基因，發(fā)現(xiàn)其在分子影像學中的表現(xiàn)較提取分離出的磁小體更好。

2.2 MagA基因在MRI報告基因中的應用 成功分離MagA基因后[16]，進一步明確了MagA與鐵調控的關系[17-18]。雖然其后趨磁細菌MSR-1菌株未能檢測到MagA[19]，且MagA位于MAI外[20]，但近年來針對MagA基因的相關分子影像學研究[21]顯示，MagA基因賦予哺乳動物細胞磁性，是一種候選MRI報告基因。

MagA在小鼠神經母細胞瘤N2A細胞中表達時，細胞質內可見磁小體樣顆粒聚集[21]，MagA活性對鐵補充有反應，細胞MRI對比度也因此增強，從而有助于進行非侵入性細胞內MR成像；且MagA無細胞毒性，同時還能調節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)，但該基因可能不受哺乳動物細胞中轉鐵蛋白受體-鐵蛋白軸的鐵穩(wěn)態(tài)調節(jié)。進一步優(yōu)化MR弛豫率測量方法后，研究[22]表明由MagA表達的磁小體樣顆粒較人重鏈和輕鏈鐵蛋白亞基表達的轉鐵蛋白具有更高的MRI信噪比。此外，通過慢病毒轉染可建立攜帶四環(huán)素反應元件(TRE)Tet-On的Tet-MagA小鼠胚胎干細胞系mESC-MagA，且可通過含有和不含MagA的小鼠胚胎干細胞系(mESC-MagA和mESC-WT)來評估移植小鼠在小鼠胚胎干細胞系中表達MagA的影響[23]。一項7.0T MR掃描儀在監(jiān)測體內具有強力霉素Dox誘導表達和非誘導表達的細胞及動物模型顱內成像研究[23]顯示，mESC-MagA可導致T2WI和磁敏感加權圖像信號顯著變化。

Guan等[24]制備了用于MRI的MagA轉基因小鼠，并評估其抗氧化酶、脂質過氧化和細胞因子的產生，發(fā)現(xiàn)鐵超負荷后，與野生型小鼠相比，MagA轉基因小鼠較少發(fā)生氧化應激水平的明顯變化，也未表現(xiàn)出明顯病理癥狀或組織學變化；在MRI信號方面，MagA過度表達導致橫向弛豫率(R2)改變，MRI可檢測到鐵過載小鼠R2中的轉基因依賴性變化。有學者[25]利用MagA轉基因小鼠評估間充質干細胞中鐵超負荷和迅速鐵螯合療法是否可以同時增加MRI檢測鐵的敏感度，并減弱對造血微環(huán)境的氧化損傷，發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，在鐵補充劑存在下，間充質干細胞表達MagA的R2*更高；與野生型小鼠相比，來自鐵過載MagA轉基因小鼠肝臟的R2*值高；此外，MagA有助于降低鐵對間充質干細胞的細胞毒性，降低p-p38絲裂原活化蛋白激酶和鐵蛋白的表達，并減少鐵過載引起的成骨分化抑制作用。

Pereira等[26]重新觀察從趨磁細菌MS-1菌株分離出來的MagA作為MRI報告基因的功效,發(fā)現(xiàn)人胚胎腎細胞HEK耐受MS-1 MagA基因的組成型表達，但在小鼠間充質/基質細胞和腎源性干細胞中誘導出強烈的毒性作用，嚴重限制MS-1 MagA基因作為干細胞報告基因的有效使用;該研究還指出，盡管有人提出MS-1 MagA參與鐵轉運，但當其在HEK細胞中表達時，不會影響與鐵穩(wěn)態(tài)相關的內源基因的轉錄；MagA誘導的HEK細胞中鐵攝取的信號增強微不足道，表明即使對于能夠耐受其表達的細胞類型，該基因也是差的報告基因，即MagA作為報告基因須謹慎使用，且其功效因細胞種類不同而異，特別是用于與再生療法相關的細胞時；此外，盡管癌細胞能耐受其表達，但必須注意確保其不會影響細胞穩(wěn)態(tài)。還有研究[20]指出，過量表達MagA細胞中的電子密集斑點實際上是鐵蛋白聚集體，而非磁小體納米顆粒本身。

2.3 mms6基因在MRI報告基因中的應用 mms6基因是MAI基因之一，與磁小體顆粒的合成、大小和分布密切相關。除在微生物學方面外，對該基因的研究還涉及綠色仿生納米粒子[27]。近期有學者[28]利用mms6基因進行MRI報告基因研究，其將mms6融合至鼠h-鐵蛋白的C-末端蛋白，作為新的嵌合磁性鐵蛋白報告基因，使得鐵蛋白生物礦化并使神經膠質瘤細胞R2增強；即使在沒有外源性鐵補充的情況下，表達mms6的腫瘤也能與不表達mms6的親代腫瘤區(qū)分開，但其潛在細胞毒性問題尚待澄清，mms6是否是一種有效遺傳MRI報告基因有待確定。

2.4 其他磁小體相關基因 鑒于已鑒定了50多種編碼磁小體相關蛋白的基因，該領域研究將有很大發(fā)展空間。相信對磁小體mamI和mamL基因在哺乳動物細胞中表達的研究[29]將會取得進一步成果。

3 展望

報告基因是分子工程的工具，可評估活細胞和整個生物體內特定啟動子的轉錄活性的位置、持續(xù)時間和程度。磁小體基因敲除研究[30]提出了1種可能性，即部分基因可用于在多種細胞類型中產生最小區(qū)室，允許鐵生物礦化用于非侵入性MR醫(yī)學成像。利用將磁小體生物礦化相關基因轉移到其他微生物的能力，很可能實現(xiàn)以更經濟的方法生產、純化磁小體，促進磁小體在生物技術和納米技術中的應用。生物安全性、細胞毒性是磁小體和磁小體相關基因利用過程中必須關注的問題，將是今后的研究方向之一。

總之，新的基因組學技術正在影響著醫(yī)學的每一個領域。基因組學和影像學的發(fā)展和結合誕生了一門新的學科——影像遺傳學。磁小體及其相關基因的研究為MRI生物醫(yī)學成像提供了新的可能性。未來相關領域的研究工作將會面臨很多挑戰(zhàn)，同時也為診治疾病帶來更多機遇。