土壤污染生態(tài)毒理診斷方法研究進(jìn)展①

王開來，苗 峰，史 柯，郭兆浩，程景顥，陳 燕

土壤污染生態(tài)毒理診斷方法研究進(jìn)展①

王開來，苗 峰，史 柯，郭兆浩，程景顥，陳 燕*

(山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院資源與環(huán)境工程學(xué)院，濟(jì)南 250100)

土壤污染診斷研究對(duì)土壤污染預(yù)警和土壤污染修復(fù)效果評(píng)價(jià)具有重要的指導(dǎo)意義。近年來土壤污染日趨嚴(yán)重，污染類型呈現(xiàn)出復(fù)合型和多樣化的趨勢(shì)，傳統(tǒng)的化學(xué)診斷法由于指標(biāo)單一、樣品前處理復(fù)雜且費(fèi)用高已不能滿足全面診斷土壤污染及評(píng)價(jià)土壤健康狀況的要求。與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷由于其靈敏度高、檢測(cè)指標(biāo)多樣、響應(yīng)快且能夠從微觀角度反映污染物脅迫效應(yīng)，成為目前土壤污染診斷領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本文綜合分析國內(nèi)外文獻(xiàn)，介紹了基于植物、動(dòng)物、微生物、細(xì)胞、分子等不同層次的診斷方法并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)作了評(píng)價(jià)，同時(shí)也對(duì)其未來發(fā)展前景做出了展望。

土壤生態(tài)毒理學(xué)；生物標(biāo)記物；分子診斷；組學(xué)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，越來越多的外源性污染物通過大氣、水體、生物等多種途徑進(jìn)入土壤環(huán)境，當(dāng)其含量超過土壤環(huán)境容納量時(shí)就會(huì)引起土壤組成、結(jié)構(gòu)、功能以及理化性質(zhì)的惡化，進(jìn)而導(dǎo)致土壤環(huán)境質(zhì)量、土壤肥力質(zhì)量和土壤健康質(zhì)量下降，甚至威脅人類和其他生物的生存與發(fā)展。據(jù)2014年《全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》，全國土壤環(huán)境狀況總體不容樂觀，土壤污染呈加劇趨勢(shì)，部分地區(qū)土壤污染嚴(yán)重超標(biāo)，總體主要具有以下特點(diǎn)：①污染類型的多樣化，呈現(xiàn)新老污染并存、無機(jī)有機(jī)復(fù)合型污染；②污染途徑的多樣化，大氣沉降、工業(yè)三廢、農(nóng)業(yè)污水灌溉、畜牧養(yǎng)殖、農(nóng)藥施入，以及城市垃圾等多途徑污染；③控制的難度化，由傳統(tǒng)的污灌型向大氣沉降型雙向污染、點(diǎn)源向面源加速延伸[1-2]。目前我國土壤污染防治面臨的形勢(shì)十分嚴(yán)峻，土壤污染診斷面臨許多新的挑戰(zhàn)，單純依靠傳統(tǒng)的化學(xué)方法進(jìn)行土壤污染診斷，已不能滿足當(dāng)前形勢(shì)的需要，不斷改進(jìn)診斷方法成為土壤修復(fù)和土壤安全利用領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[3-4]。

近年來土壤污染生態(tài)毒理診斷法受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注并得以迅速發(fā)展。它通過外源污染物對(duì)受試生物(植物、動(dòng)物、微生物)在分子、細(xì)胞、器官、個(gè)體、種群及群落等不同生命層次上的脅迫效應(yīng)來評(píng)估土壤的污染程度。該方法闡明了有毒物質(zhì)對(duì)生命有機(jī)體的危害機(jī)理，建立了污染物對(duì)受試生物的劑量-效應(yīng)模型，集合了土壤中不同食物鏈生物對(duì)化學(xué)品的整體毒性效應(yīng)，能夠?yàn)橥寥牢廴撅L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供較詳細(xì)的信息，同時(shí)也能為土壤污染修復(fù)提供可靠的依據(jù)。本文就土壤生態(tài)毒理學(xué)常用的診斷方法進(jìn)行綜述和展望。

1 陸生生物生態(tài)毒理學(xué)診斷

1.1 高等植物法

高等植物是生態(tài)系統(tǒng)中的生產(chǎn)者，利用其生長狀況來診斷土壤污染，是土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷常用的方法。其原理是通過土壤污染物對(duì)植物形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理生化、遺傳、生長等特性的影響，對(duì)種群數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和功能以及生物多樣性的改變，獲取相關(guān)信息來表征土壤污染情況[5-6]。目前常采用土壤栽培(包括室外大田試驗(yàn)和室內(nèi)栽培)、水培、濾紙法等研究方法，從污染物的劑量-反應(yīng)關(guān)系、混合污染毒性與土壤營養(yǎng)物質(zhì)濃度水平的關(guān)系等方面，探索污染物在植物體內(nèi)的遷移、積累和轉(zhuǎn)化規(guī)律[7-8]。符博敏等[9]通過根伸長抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，土壤中的恩諾沙星與Cu的復(fù)合污染對(duì)白菜和西紅柿兩種作物的根伸長和芽伸長具有明顯的抑制作用，且恩諾沙星與Cu(100、300 mg/kg)復(fù)合污染對(duì)根及芽伸長抑制效應(yīng)均表現(xiàn)為協(xié)同作用。雖然該方法能夠?yàn)橹亟饘俸涂股貜?fù)合污染土壤的早期診斷與治理提供科學(xué)依據(jù)，但此方法靈敏度低，受試植物的生長易受各種環(huán)境因素的影響，且試驗(yàn)周期長，操作復(fù)雜需配合精密儀器進(jìn)行檢測(cè)，不適合土壤污染的現(xiàn)場快速靈敏檢測(cè)[10]。

1.2 動(dòng)物診斷法

1.2.1 陸生無脊椎動(dòng)物毒性試驗(yàn) 陸生無脊椎動(dòng)物處于陸地食物鏈的底層，繁殖能力強(qiáng)，分布廣，且能最大限度地接觸土壤中的有害物質(zhì)，其生命活動(dòng)和代謝活動(dòng)與土壤環(huán)境有著密切的聯(lián)系，在評(píng)估土壤質(zhì)量和化學(xué)污染物潛在的毒性方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[11]。陸生無脊椎動(dòng)物種類繁多，研究者常以蚯蚓()、線蟲和跳蟲為指示生物，利用它們的成長試驗(yàn)、回避行為試驗(yàn)和繁殖試驗(yàn)來評(píng)價(jià)污染土壤的生態(tài)毒性[12]。Sillapawattana和Sch?ffer[13]研究了蚯蚓對(duì)吡蟲啉的毒性響應(yīng)，Demuynck等[14]研究了蚯蚓對(duì)重金屬與有機(jī)物復(fù)合污染土壤的回避行為，這些研究表明大部分有機(jī)物、重金屬的單一或復(fù)合污染均對(duì)蚯蚓產(chǎn)生毒害效應(yīng)。雖然，目前以蚯蚓為生物標(biāo)記物的研究已經(jīng)日臻完善，但蚯蚓作為指示生物在污染場地的實(shí)際應(yīng)用方面研究較少，且缺乏相應(yīng)的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。與其他無脊椎動(dòng)物相比，跳蟲中的白符跳對(duì)污染物更為敏感，劉玉榮等[15]研究發(fā)現(xiàn)抑菌靈對(duì)赤子愛勝蚯蚓的半致死濃度(LC50)高于1 000 mg/kg，而對(duì)白符跳的LC50值僅為0.072 mg/kg。雖然跳蟲的種群以及群落結(jié)構(gòu)、物種組成的動(dòng)態(tài)變化反映了真實(shí)土壤環(huán)境的生態(tài)效應(yīng)，可以更切實(shí)地對(duì)土壤污染狀況進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，但是其種群和群落結(jié)構(gòu)的分布易受土壤理化性質(zhì)和氣象因素的影響。Dai等[16]研究了重金屬對(duì)白符跳抗氧化酶及回避反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)白符跳體內(nèi)Cd含量的變化和抗氧化酶活性變化一致，其回避率和重金屬含量呈正相關(guān)關(guān)系，可用來評(píng)價(jià)土壤重金屬的毒性效應(yīng)；但該研究同時(shí)指出土壤的理化性質(zhì)會(huì)影響白符跳的抗氧化酶活性，因此在利用該生物進(jìn)行土壤污染指示時(shí)應(yīng)該充分考慮這些因素的影響[16]。

1.2.2 土壤原生動(dòng)物毒性試驗(yàn) 土壤原生動(dòng)物泛指生活在土壤或土壤表面凋落物中的自由生活原生動(dòng)物，由于其個(gè)體簡單、易于培養(yǎng)、繁殖速度快、分布不受地域限制、對(duì)極端環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)且能夠在很短的時(shí)間做出響應(yīng)，是重金屬和農(nóng)藥污染物毒性診斷較為理想的模式生物[17]。常見的土壤原生動(dòng)物主要有4類：纖毛蟲類、異養(yǎng)鞭毛蟲類、裸肉足蟲類和有殼肉足蟲類。黃敦奇等[18]通過研究廢棄農(nóng)藥廠污染土壤中原生動(dòng)物的數(shù)量和種類發(fā)現(xiàn)，鞭毛蟲、纖毛蟲等原生動(dòng)物的數(shù)量和土壤全氮含量呈正相關(guān)，肉足蟲數(shù)量與土壤全磷含量有明顯的正相關(guān)，且污染場地中長期殘留的有機(jī)氯農(nóng)藥對(duì)土壤原生動(dòng)物數(shù)量有明顯的抑制作用。Zhang等[19]研究了梨形四膜蟲()對(duì)Cu、Cd、Cr(III)和氯苯復(fù)合污染的毒性響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)重金屬和對(duì)氯苯對(duì)四膜蟲的毒害具有拮抗效應(yīng)，而重金屬與鄰氯苯，Cu和1,2,4-三氯苯則有協(xié)同作用。然而原生動(dòng)物在土壤監(jiān)測(cè)中也有很多不足之處，主要表現(xiàn)在：①原生動(dòng)物受土壤理化性質(zhì)和其他環(huán)境因子的影響較大；②種類多，鑒定困難，只能粗略地估計(jì)原生動(dòng)物的數(shù)量，無法把采樣時(shí)活動(dòng)的和形成包囊的數(shù)量區(qū)分開來；③數(shù)量大，計(jì)數(shù)費(fèi)時(shí)，常會(huì)過高或過低地估計(jì)原生動(dòng)物的個(gè)體豐度[20]。此外分類學(xué)上的欠缺也是阻礙土壤原生動(dòng)物作為指示生物的瓶頸[21]。

2 水生生物毒理學(xué)診斷方法

2.1 藻類試驗(yàn)

藻類由于其培養(yǎng)方便、個(gè)體小、繁殖快、靈敏度高而被列入經(jīng)濟(jì)合作發(fā)展組織(OECD)標(biāo)準(zhǔn)水毒性監(jiān)測(cè)體系，但是受藻類自身生存環(huán)境的制約應(yīng)用到土壤污染生態(tài)毒理診斷的研究較少，目前多集中在田間持水量較高的南方水稻田中可持久性有機(jī)污染物(POPs)的生態(tài)毒理評(píng)估。黃健等[22]對(duì)已登記的36種除草劑進(jìn)行了藻類急性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制植物細(xì)胞分裂和作用于植物葉綠體的除草劑72 h-EC50(1.01×10–3~ 2.5 mg/L)對(duì)綠藻毒性遠(yuǎn)大于以人工合成植物生長素72 h-EC50( 3.34 ~ 143 mg/L)為代表的除草劑；此外，在作用方式相同的情況下，旱田獲得登記的除草劑對(duì)藻類的毒性高于水稻田上獲得登記的除草劑對(duì)藻類的毒性。目前大多數(shù)研究都是通過分析土壤提取液對(duì)污染土壤毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，忽視了土壤原生環(huán)境對(duì)藻類的影響，檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定的偏差[23]。

2.2 發(fā)光菌試驗(yàn)

發(fā)光細(xì)菌是一種靈敏度比較高的菌種，在正常的生存環(huán)境下，細(xì)菌的熒光酶催化熒光素釋放出肉眼可見的藍(lán)綠熒光；但當(dāng)受到外界不良影響時(shí)，發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度減弱且其強(qiáng)度的變化與污染物劑量或毒性強(qiáng)度呈劑量-反應(yīng)線性關(guān)系，基于此可進(jìn)行污染物毒性評(píng)價(jià)[24]。國內(nèi)外對(duì)發(fā)光細(xì)菌的研究比較早，目前常用明亮發(fā)光桿菌()、費(fèi)氏弧菌()、青?；【?)對(duì)環(huán)境污染物進(jìn)行檢測(cè)。其中青海弧菌 (sp.-Q67)是我國學(xué)者從青海湖的青海裸鯉()體表分離出來的一種天然發(fā)光特性好、無致病性的淡水型發(fā)光菌，以該細(xì)菌為指示生物，可建立應(yīng)用于水環(huán)境樣品的發(fā)光毒性測(cè)試方法。Xu等[25]對(duì)比研究了青?；【c明亮發(fā)光桿菌和費(fèi)氏弧菌對(duì)土壤中爆炸污染物提取液的急性毒性響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)青海弧菌對(duì)不同濃度TNT提取液的響應(yīng)最敏感，且響應(yīng)受暴露時(shí)間長短的影響最小，更適合作為土壤爆炸污染物的急性毒性指示生物。另外，常用方法還有Microtox 檢驗(yàn)法[26]，但是該法對(duì)樣品的pH(6 ~ 8)要求較高，超出pH范圍會(huì)影響試驗(yàn)的效果。

2.3 大型蚤毒性試驗(yàn)

大型蚤作為一種常用的測(cè)試生物，具有易培養(yǎng)、世代短、易繁殖、產(chǎn)量多等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)廢水、土壤及城市污泥毒性監(jiān)測(cè)方面多有應(yīng)用。目前，大型蚤() 是一些國際組織(如OECD 和ISO) 正式簽署的唯一一種用于毒性試驗(yàn)的淡水無脊椎動(dòng)物，常用其死亡率、繁殖率和運(yùn)動(dòng)抑制率來診斷土壤污染程度。然而蚤毒性試驗(yàn)前處理比較復(fù)雜、靈敏度低、試驗(yàn)時(shí)間長且關(guān)于污染脅迫對(duì)大型蚤新陳代謝系統(tǒng)的研究較少，對(duì)蚤毒性試驗(yàn)還需做進(jìn)一步研究[27-29]。

3 土壤微生物毒性診斷法

3.1 微生物群落檢測(cè)法

微生物群落功能的差異性對(duì)環(huán)境變化十分敏感，能夠在很短的周期內(nèi)做出反應(yīng)，常常被用作土壤生態(tài)系統(tǒng)變化和土壤健康狀況的早期預(yù)警和敏感指標(biāo)[30]。微生物群落功能的差異通常是用反映微生物群落對(duì)含碳底物代謝功能多樣性的群落水平生理特征(CLPP)來表征。目前檢測(cè)土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的方法主要有磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法、Biolog微平板法、多重底物誘導(dǎo)呼吸(multi-SIR)、MicroRespTM方法[31-33]。Chapman等[34]通過將MicroRespTM與Biolog平板法和multi-SIR法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，MicroRespTM既保留了Biolog平板法簡單易于操作和multi-SIR法利用全土的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也改進(jìn)了Biolog平板法依賴土壤懸浮液提取物和細(xì)胞后續(xù)生長狀況以及只能測(cè)定可培養(yǎng)微生物的限制和multi- SIR法自動(dòng)化程度低、操作繁瑣等缺點(diǎn)，是一種簡單快捷有效的方法，常用來研究長期施肥和耕作制度對(duì)土壤微生物群落生理水平的影響。雖然有研究者也將土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)做為評(píng)價(jià)土壤重金屬生態(tài)毒性的生物學(xué)指標(biāo)[34]，但是土壤水分、土壤pH以及土壤稀釋液的濃度和稀釋液中的干擾物質(zhì)都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響[35]。

3.2 土壤酶活性檢測(cè)法

土壤酶是土壤中產(chǎn)生專一生物化學(xué)反應(yīng)的生物催化劑，對(duì)外源性污染物如重金屬、有機(jī)污染物有明顯的響應(yīng)，常被用作土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷的重要生物指標(biāo)，目前主要通過監(jiān)測(cè)土壤酶活性的抑制程度判斷土壤污染程度，評(píng)價(jià)土壤健康質(zhì)量[36-39]。Angelovi-?ová等[40]發(fā)現(xiàn)在Cu、Zn、Pb復(fù)合污染下，隨著重金屬含量的增加，土壤脲酶(URE)、酸性磷酸酶(ACP)的活性受到抑制，尤其土壤脲酶受Pb、Zn的抑制更為明顯。Lipińska等[41]通過測(cè)定芳基硫酸酯酶對(duì)多環(huán)芳烴(PAHs)的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在土壤彈性指數(shù)較小時(shí)，PAHs可引起芳基硫酸酯酶持續(xù)的失調(diào)。雖然土壤酶能夠比較客觀地評(píng)價(jià)重金屬復(fù)合污染和重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染，但是由于土壤酶活性受土壤性質(zhì)的影響較大，酶活性與土壤重金屬含量之間的定量關(guān)系仍未完全弄清，目前土壤酶活性還不能作為重金屬有效性評(píng)價(jià)的重要方法。下一步需通過深入研究土壤性質(zhì)和土壤類型的差異，建立定量模型，將其與土壤重金屬污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)結(jié)合起來[42]，促進(jìn)該方法的進(jìn)一步發(fā)展。

3.3 土壤呼吸檢測(cè)法

土壤呼吸作用強(qiáng)度是衡量土壤微生物活性的重要指標(biāo)，其變化能夠反映土壤微生物的活躍程度，可作為表征土壤肥力和土壤質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)，但專門把土壤呼吸作用作為微生物活性指標(biāo)用于土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷的研究是近幾年來才興起的[43-44]?，F(xiàn)階段土壤呼吸測(cè)定方法主要有渦度相關(guān)法、靜態(tài)堿液吸收法、靜態(tài)密閉氣室法、動(dòng)態(tài)氣室法和間接檢測(cè)法。靜態(tài)堿液吸收法是以土壤排放的CO2總量為指標(biāo)，設(shè)備簡單易于操作、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性強(qiáng)、適于空間異質(zhì)性大的土壤，但該法需人工采樣，精確度不高。動(dòng)態(tài)氣室法雖然克服檢測(cè)精度差的缺點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、技術(shù)要求高、設(shè)備比較昂貴；而間接檢測(cè)法是通過測(cè)定土壤呼吸相關(guān)指標(biāo)(如溫度、水分及腺苷(ATP)含量等)推算土壤呼吸速率，只適合特定的生態(tài)系統(tǒng)，不具備普適性。自動(dòng)氣室法是在動(dòng)態(tài)氣室法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在測(cè)量準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和使用性等方面都有所改進(jìn)，受到眾多研究者的青睞。周涵君等[45]利用該法發(fā)現(xiàn)外源添加Cd對(duì)根系土壤呼吸有明顯抑制，其原因是Cd的毒害作用使土壤微生物活性顯著降低且煙株根系生長緩慢，從而使土壤呼吸速率降低。隨著對(duì)土壤的地域差異以及對(duì)土壤復(fù)合污染研究的逐漸深入，土壤呼吸檢測(cè)法不失為一種良好的土壤生態(tài)毒理診斷方法。

3.4 土壤氮循環(huán)檢測(cè)法

土壤氮循環(huán)是評(píng)價(jià)污染物對(duì)土壤微生物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)，主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用[46]，其中氨氧化作用是全球氮循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。土壤氨氧化細(xì)菌和古菌(AOB、AOA)是進(jìn)行氨氧化作用的主要微生物，都含有編碼氨單加氧酶(AMO)，該酶是硝化反應(yīng)中氨氧化的關(guān)鍵酶，可將氨轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，對(duì)土壤環(huán)境因子的變化具有潛在的指示作用[47]。李平等[48]發(fā)現(xiàn)向土壤中添加 Cu、Cd 等重金屬離子會(huì)抑制土壤的硝化作用、反硝化作用和礦化作用，其原因主要是AOA和AOB活動(dòng)受到重金屬的抑制，難以進(jìn)行氨氧化。此外，有研究表明有機(jī)磷、有機(jī)碳，全氮等土壤理化性質(zhì)可以通過改變AOA和AOB的豐度，從而進(jìn)一步影響土壤氨氧化作用，今后，為防止土壤理化性質(zhì)對(duì)毒理試驗(yàn)的干擾，可采用控制土壤理化性質(zhì)線性影響的偏相關(guān)分析方法進(jìn)行研究[49]。

4 細(xì)胞水平上的生態(tài)毒理學(xué)診斷

4.1 微核試驗(yàn)

微核試驗(yàn)是一種新型的土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷方法，其原理是外界土壤中有毒物質(zhì)對(duì)受試生物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致其細(xì)胞染色體丟失或斷裂，從而在細(xì)胞質(zhì)中形成一個(gè)或多個(gè)微小核，通過觀測(cè)出現(xiàn)的微核率來判斷污染土壤的生態(tài)毒性，具有方便、快捷、高效等優(yōu)點(diǎn)[50]，多用來檢測(cè)水體污染狀況和水體的致突變性。由于其微核率和染色體畸變率與農(nóng)藥、重金屬等毒物的劑量有較好的相關(guān)性，近年來以蠶豆根尖微核試驗(yàn)為代表的實(shí)驗(yàn)方法在土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷方面逐漸引起人們的重視。王興明等[51]在評(píng)價(jià)煤礦區(qū)土壤重金屬風(fēng)險(xiǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于蠶豆發(fā)芽率和根伸長試驗(yàn)，蠶豆根微核試驗(yàn)對(duì)重金屬更為敏感。但這類方法仍涉及一些重要的方法學(xué)問題值得深入探討和研究，比如傳統(tǒng)的試驗(yàn)方法，注重觀察記錄處于細(xì)胞分裂間期的微核細(xì)胞，忽視了分裂期細(xì)胞的遺傳損傷，沒有要求記錄和統(tǒng)計(jì)上述的染色體畸變，沒有要求記錄有絲分裂相的細(xì)胞數(shù)等。因此，下一步還需著重培養(yǎng)對(duì)污染物敏感的蠶豆品種，并結(jié)合其他手段，提高微核判斷的準(zhǔn)確度，以便更好地服務(wù)于環(huán)境監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)等領(lǐng)域[52]。

4.2 溶酶體中性紅法

隨著近年來對(duì)溶酶體結(jié)構(gòu)和功能的深入研究發(fā)現(xiàn)，溶酶體是亞細(xì)胞水平上有毒物質(zhì)的特殊靶點(diǎn)。蚯蚓體腔細(xì)胞內(nèi)的溶酶體由于其成本低、樣品處理簡單、觀察效果好，是目前最常用的生物標(biāo)志物[53-54]。溶酶體對(duì)中性紅具有很強(qiáng)的親和性，蚯蚓體腔細(xì)胞內(nèi)的溶酶體能很快地積累中性紅染料，當(dāng)有毒物質(zhì)進(jìn)入受試生物的細(xì)胞內(nèi)時(shí)，其溶酶體膜受到損傷，導(dǎo)致溶酶體膜通透性改變，失去穩(wěn)定性，中性紅染料逐步滲透到細(xì)胞質(zhì)中，根據(jù)細(xì)胞溶酶體膜中性紅保持時(shí)間建立劑量-效應(yīng)關(guān)系來診斷土壤污染程度。該方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，常被用作土壤污染的早期預(yù)警[55]。Wang等[56]采用該方法分析了土壤中不同砷化物的毒性，結(jié)果表明As(III)> As(V)>單甲基胂酸鹽(MMA)>二甲基胂酸鹽(DMA)。Lee等[57]也通過該方法做了關(guān)于砷毒性的試驗(yàn)，同樣得到了相似的結(jié)果。馬靜靜[58]等通過疊加污染的方式模擬PHAs在土壤中的積累，發(fā)現(xiàn)PHAs的毒性與中性紅保留時(shí)間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。然而針對(duì)低劑量污染物的毒性診斷不明顯，需結(jié)合其他多指標(biāo)和多時(shí)段的檢測(cè)，增強(qiáng)指示的靈敏度和有效性。

4.3 單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)

單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)又稱彗星試驗(yàn)，是近幾年發(fā)展起來的一門DNA檢驗(yàn)技術(shù)，以其快速、簡單、靈敏度高而受到廣泛的關(guān)注[59]。高曦等[60]利用蠶豆為研究對(duì)象，以菲為PAHs代表物，開展彗星試驗(yàn)研究，以O(shè)live尾動(dòng)量(OTM)作為PAHs污染的DNA損傷效應(yīng)評(píng)價(jià)參數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)在0 ~ 0.6 mg/L菲污染脅迫下，蠶豆根尖細(xì)胞內(nèi)的DNA受到明顯的損害，且DNA損傷程度與菲脅迫呈正相關(guān)。公新忠等[61]采用彗星試驗(yàn)研究了6種不同濃度梯度(1 000、800、600、400、200、100 μmol/L)的鈾脅迫對(duì)大豆和玉米幼苗細(xì)胞的DNA損傷程度，發(fā)現(xiàn)1 000 μmol/L和800 μmol/L對(duì)大豆和玉米幼苗細(xì)胞DNA的損傷情況較嚴(yán)重，其他濃度不明顯。

5 生物標(biāo)記法

5.1 解毒酶系生物標(biāo)記法

解毒酶是一類具有重要生理功能的代謝酶系，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。它們易受外源污染物誘導(dǎo)或抑制而使其含量或活力顯著增加或降低，且污染物毒性與其含量或活力之間具有顯著相關(guān)性[62]，常作為毒物毒性診斷的生物標(biāo)記物用于環(huán)境污染的早期診斷。目前用于土壤生態(tài)毒理診斷的解毒酶主要有細(xì)胞色素酶(CytP450)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)。楊曉霞等[63]通過研究蚯蚓細(xì)胞色素P450酶系不同亞酶對(duì)土壤中芘或苯并[a]芘的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，芘或苯并[a]芘暴露導(dǎo)致蚯蚓CYPs總量、CYP1A1及CYP2C9活性的變化不同，提出了利用CYPs總量與CYP1A1活性結(jié)合或與CYP2C9活性結(jié)合來診斷土壤芘污染或苯并[a]芘污染較為準(zhǔn)確有效。趙歡等[64]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450基因表達(dá)與苯并[a]芘誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間呈正相關(guān)。Sillapawattana等[65]從分子水平上研究了白符跳()中GSTs對(duì)吡蟲啉的毒性效應(yīng)，該試驗(yàn)為煙堿類農(nóng)藥毒理學(xué)試驗(yàn)提供了可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道，大多數(shù)研究集中在有機(jī)磷和有機(jī)氯為代表的農(nóng)藥方面，對(duì)其他有機(jī)污染物和重金屬毒性的研究相對(duì)較少，且大多數(shù)試驗(yàn)僅僅停留在劑量-毒性的關(guān)系上，并沒有進(jìn)行分子生物學(xué)水平上的研究。此外這些研究還僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，并沒有真正用于實(shí)際污染場地的預(yù)警和監(jiān)測(cè)。

5.2 抗氧化防御系統(tǒng)的生物標(biāo)記法

抗氧化防御系統(tǒng)是動(dòng)物體內(nèi)重要的活性氧物質(zhì)清除系統(tǒng)，當(dāng)受試的好氧生物受到土壤外源污染物的脅迫時(shí)，體內(nèi)的活性氧物質(zhì)會(huì)增加，隨著受試生物暴露時(shí)間的延長，當(dāng)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)累積過多時(shí)，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在長期的進(jìn)化過程中，需氧生物形成了一套抗氧化防御體系，以減緩活性氧的損傷攻擊。生物體內(nèi)抗過氧化物的酶系有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等，它們含量的維持和提高是生物體耐受污染脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，可作為指示污染土壤毒性的敏感生物標(biāo)記物。唐浩等[66]發(fā)現(xiàn)Hg污染脅迫對(duì)蚯蚓的SOD、GSH-PX的活性具有抑制作用，而對(duì)CAT的影響無明顯規(guī)律。張聰?shù)萚67]發(fā)現(xiàn)Pb對(duì)蚯蚓體內(nèi)的SOD、CAT、POD的活性均有抑制作用，并且CAT和SOD在Pb脅迫下的活性變化趨勢(shì)基本一致。此外，不同重金屬污染脅迫對(duì)蚯蚓抗氧化酶活性的影響是不同的，通過研究重金屬復(fù)合污染對(duì)蚯蚓的抗氧化酶活性的影響發(fā)現(xiàn)，Pb和Cd-Cu-Pb對(duì)SOD活性產(chǎn)生的影響最為顯著，而Cd和Cu對(duì)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和磷酸酯酶(AP)的活性產(chǎn)生的影響比較明顯[68]。雖然受外源污染物脅迫后機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中抗氧化酶的活性會(huì)有顯著變化，但它們的改變卻很難得到良好的劑量-反應(yīng)線性關(guān)系，例如高濃度的污染物對(duì)酶活性的抑制并不明顯。

5.3 熱休克蛋白生物標(biāo)記法

熱休克蛋白(HSP)是機(jī)體受到外源污染物以及不良理化環(huán)境刺激后產(chǎn)生的一種應(yīng)激蛋白，廣泛存在于各類生物體內(nèi)，并在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能。作為一類高度保守的蛋白質(zhì)，它可以提高受試細(xì)胞的耐受性，對(duì)生物細(xì)胞具有保護(hù)和修復(fù)作用，可作為評(píng)價(jià)外源污染物整體脅迫效應(yīng)和污染程度的早期毒理學(xué)指標(biāo)[69-70]。按照分子量可將其分為4個(gè)家族：HSP60、HSP70、HSP90和HSP100。其中HSP70是4個(gè)家族中最為保守的，對(duì)亞砷酸、重鉻酸鹽、Cd2+、Cu2+、五氯酚和林丹等污染物的脅迫響應(yīng)十分顯著，作為生物指標(biāo)物在土壤生態(tài)毒性早期診斷方面具有很大的潛力[71]。Wang等[72]發(fā)現(xiàn)蠶豆中HSP70的含量在Pb脅迫誘導(dǎo)下從原來的125 mg/kg上升到1 000 mg/kg，比SOD、POD、APX、CAT等標(biāo)記物對(duì)Pb的響應(yīng)更敏感。Ezemaduka等[73]以小分子熱休克蛋白(sHSP)為生物標(biāo)記物，采用蛋白質(zhì)免疫雜交方法，實(shí)現(xiàn)了重金屬污染物的定量檢測(cè)。

5.4 膽堿酯酶標(biāo)記法

膽堿酯酶是一類專一性比較高的酶，分為乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。其中乙酰膽堿酯酶對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥和有機(jī)磷農(nóng)藥具有顯著的靈敏性和較高的專一性而獲到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用[74]。汪鵬鵬等[75]在研究辛硫磷和敵百蟲協(xié)同污染對(duì)斑馬魚乙酰膽堿酯酶活性抑制時(shí)發(fā)現(xiàn)，膽堿酯酶不僅與單一污染具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，而且與復(fù)合污染也具有明顯的劑量–效應(yīng)關(guān)系，且響應(yīng)更為靈敏。此外，有學(xué)者基于乙酰膽堿酯酶修飾電極制成了靈敏度高、選擇性好以及干擾小的電化學(xué)酶傳感器，實(shí)現(xiàn)了農(nóng)產(chǎn)品和土壤樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的高選擇高靈敏檢測(cè)[76-77]。

6 組學(xué)在生態(tài)毒理學(xué)上的應(yīng)用

土壤污染的生態(tài)毒理學(xué)診斷不僅僅局限于對(duì)單一受試物種或生物標(biāo)記物的檢測(cè)，還可以從更宏觀的群落結(jié)構(gòu)、生態(tài)系統(tǒng)和更微觀的代謝、遺傳水平上評(píng)價(jià)[78]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、宏蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)研究土壤微生物的生態(tài)功能，揭示土壤微域環(huán)境對(duì)微生物的影響機(jī)制，在評(píng)價(jià)污染土壤生態(tài)毒理學(xué)方面具有巨大的潛力。當(dāng)前組學(xué)在土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷上的應(yīng)用主要表現(xiàn)在4個(gè)方面。

宏基因組學(xué)是在微生物基因組學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，它是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體，通過對(duì)微生物群落上DNA多態(tài)性的測(cè)量，分析污染脅迫對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)和種群多樣性的毒性效應(yīng)，解決了大部分微生物因不能分離培養(yǎng)而難于研究的問題[79]。高通量測(cè)序和基因芯片技術(shù)是宏基因兩大關(guān)鍵技術(shù)，與其他傳統(tǒng)技術(shù)相比，具有很高的準(zhǔn)確性、全面性及較高的信息深入程度。夏圍圍和賈仲君[80]對(duì)比了高通量測(cè)序和傳統(tǒng)的變性梯度凝膠電泳(DGGE)指紋圖譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)高通量測(cè)序無論是在檢測(cè)的靈敏度還是在測(cè)量微生物的豐度，以及優(yōu)勢(shì)種篩選中都要優(yōu)于DGGE；然而DGGE能夠更加直觀地比較和分析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，這是高通量測(cè)序技術(shù)的不足之處。與高通量測(cè)序相比，基因芯片技術(shù)具有污染物干擾和群落主要物種干擾較小的優(yōu)點(diǎn)[81]，有學(xué)者將其應(yīng)用到石油烴污染土壤微生物的生理活性和群落結(jié)構(gòu)的研究中[82]。然而基因芯片技術(shù)不能夠發(fā)現(xiàn)新的物種，也不能直接表征微生物的群落多樣性和豐富度，隨著16S rDNA測(cè)序技術(shù)的成熟，這一點(diǎn)將會(huì)得到改善。因此，在今后的研究中應(yīng)該結(jié)合各種技術(shù)，取長補(bǔ)短促進(jìn)土壤生態(tài)毒理學(xué)基因組學(xué)的發(fā)展。

宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在宏基因組學(xué)之后興起的一門新學(xué)科，利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)分析受污染脅迫下的生物生理活性在時(shí)間序列上的動(dòng)態(tài)變化，并獲取所有可能的有毒物質(zhì)對(duì)受試生物的脅迫的表達(dá)響應(yīng)譜。該技術(shù)不僅具有宏基因組技術(shù)的全部優(yōu)點(diǎn)，而且能夠?qū)ξ⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)及代謝、功能間的關(guān)系進(jìn)行剖析和監(jiān)測(cè)，可直接反映實(shí)時(shí)環(huán)境表達(dá)信息。其基本流程為：①環(huán)境樣品的采集與保存；②總RNA的提??；③mRNA富集；④cDNA文庫的建立；⑤測(cè)序并獲得大量的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)的序列，并對(duì)其進(jìn)行基因功能的注釋[83]。de Menezes等[84]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究了菲脅迫下土壤樣品中微生物活性的變化，發(fā)現(xiàn)涉及芳香族化合物代謝及脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著增加。轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展至今已經(jīng)不在局限于土壤污染脅迫對(duì)微生物群落的影響，而是已應(yīng)用到土壤污染對(duì)植物脅迫機(jī)制的研究中。Zhang等[85]通過RNA-Seq研究了Cd脅迫下甘藍(lán)型油菜籽中金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MTGs)，發(fā)現(xiàn)270個(gè)MTGs中有202個(gè)非冗余MTGs，其中108個(gè)MTGs差異表達(dá)，68個(gè)MTGs受到Cd顯著的誘導(dǎo)作用。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究工作目前尚處于初級(jí)階段，仍存在環(huán)境樣品mRNA含量低、腐植酸等干擾雜質(zhì)多、rRNA去除程度有限等諸多問題有待解決[83]。

宏蛋白組學(xué)是應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)微生物群落進(jìn)行研究的一項(xiàng)新技術(shù)。通過研究外源化學(xué)毒物對(duì)生物體所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)及其導(dǎo)致的生物體內(nèi)代謝通路的改變，可以更加全面地發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)蛋白水平的細(xì)微變化及其變化之間的聯(lián)系，為研究者分析污染物的毒性機(jī)制和生物體的關(guān)鍵蛋白防御機(jī)制提供了有力的手段。Zhang等[86]使用蛋白組學(xué)技術(shù)比較了蚯蚓()對(duì)紅壤中苯并[a]芘和Cd的毒性響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)苯并[a]芘暴露顯著誘導(dǎo)氧化還原蛋白的表達(dá)，而Cd暴露主要誘導(dǎo)參與轉(zhuǎn)錄和翻譯相關(guān)過程蛋白質(zhì)的表達(dá)；此外，還發(fā)現(xiàn)苯并[a]芘能明顯地誘導(dǎo)高水平的活性氧物質(zhì)(ROS)。許多污染物的毒性效應(yīng)和受試生物的體內(nèi)蛋白有密切的關(guān)系，單純的從基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)很難細(xì)致分析污染物的毒性機(jī)制，而基于蛋白水平上的蛋白組學(xué)則具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)，但是如何從環(huán)境中高效分離提取蛋白一直是制約蛋白組學(xué)發(fā)展的一個(gè)瓶頸。因此，在未來的研究中應(yīng)該注重尋找具有普適性、易于操作的蛋白提取技術(shù)[87-88]。

宏代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)后出現(xiàn)的新興“組學(xué)”。通過研究機(jī)體受刺激后體液或組織中內(nèi)源性代謝物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，并結(jié)合生物信息統(tǒng)計(jì)方法，系統(tǒng)全面地揭示內(nèi)因和外因作用于機(jī)體的毒性效應(yīng)和機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物提供了新的途徑[89]。Tang等[90]通過研究紅壤和潮土兩種不同類型土壤下Pb和Cd脅迫對(duì)蚯蚓()代謝產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種Pb污染土壤中蚯蚓分泌物中氨基酸和核酸代謝物明顯高于對(duì)照組，而甜菜堿和肌醇要低于對(duì)照組；而Cd污染紅壤中蚯蚓的代謝產(chǎn)物變化較小，其中代謝產(chǎn)物較高的是一些氨基酸類物質(zhì)、二甲胺、肌苷和AMP(腺嘌呤核糖核苷酸)，而組氨酸、甜菜堿、NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADPH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)等要低于對(duì)照組。代謝組學(xué)作為一種相對(duì)年輕的技術(shù)，未來應(yīng)該通過與其他組學(xué)及傳統(tǒng)的毒理學(xué)檢測(cè)方法相結(jié)合，建立一套系統(tǒng)的污染物代謝分析方法。

與傳統(tǒng)的生態(tài)毒理診斷方法相比，利用組學(xué)在宏基因、宏蛋白、宏轉(zhuǎn)錄以及宏代謝水平上進(jìn)行生態(tài)毒性檢測(cè)具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。然而土壤生態(tài)毒理學(xué)組學(xué)仍然受到多種因素的制約，例如如何從海量數(shù)據(jù)獲取準(zhǔn)確客觀的信息，以及如何避免在提取時(shí)土壤樣品不受其他因素的影響等都是需要深入研究的問題。

7 展望

近年來，土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷在土壤重金屬、有機(jī)污染物檢測(cè)等方面取得了很大的進(jìn)步，在土壤環(huán)境基準(zhǔn)/閾值及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中也發(fā)揮了重要作用，同時(shí)也為后期高效合理的土壤污染修復(fù)提供了技術(shù)支撐和理論依據(jù)。目前土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷方法正朝著以下幾個(gè)方面發(fā)展：①簡單的劑量-效應(yīng)關(guān)系已經(jīng)不能滿足檢測(cè)的要求，從分子、基因、細(xì)胞水平上來探究低濃度甚至是痕量污染物的生態(tài)毒性成為未來研究的重點(diǎn)；②組學(xué)能夠在基因水平上更深入地理解環(huán)境污染物的致毒機(jī)制，為生態(tài)毒理學(xué)尋找響應(yīng)更為敏感的生物標(biāo)記物提供可能，在傳統(tǒng)的分析方法的基礎(chǔ)上，多組學(xué)聯(lián)合檢測(cè)是未來土壤污染物生態(tài)毒理學(xué)診斷方法的發(fā)展方向之一；③傳統(tǒng)的分析方法已經(jīng)不能滿足時(shí)代的需要，多學(xué)科交叉融合是未來土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷方法研究和發(fā)展的一個(gè)大趨勢(shì)，比如和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合制成靈敏度更高的生物傳感器，同現(xiàn)代儀器分析技術(shù)相結(jié)合來提高診斷的準(zhǔn)確性；④應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)新型污染物的環(huán)境行為及毒理效應(yīng)的研究，例如微塑料、塑料薄膜、納米銀、抗生素等；⑤我國土壤種類眾多，不同地區(qū)土壤之間的理化性質(zhì)差異較大，因此，在進(jìn)行土壤污染生態(tài)毒理學(xué)診斷時(shí)，還應(yīng)該結(jié)合其他的評(píng)估方法，做到土壤污染評(píng)估的客觀性?？傊?，隨著土壤污染問題的日益突出，以及人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，土壤生態(tài)毒理學(xué)診斷必將受到越來越多的環(huán)境科研工作者們的重視。

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Research Advances in Eco-toxicological Diagnosis Methods of Soil Pollution

WANG Kailai, MIAO Feng, SHI Ke, GUO Zhaohao, CHENG Jinghao, CHEN Yan*

(College of Environmental Science and Engineering, Shandong Agriculture and Engineering University, Jinan 250100, China)

Diagnosis of soil pollution has important guiding significance for early warning of soil pollution and evaluating the remediation effect. In recent years, soil pollution is becoming more and more serious and pollution type presents a complicated and diversified trend, so the traditional chemical method cannot meet the requirements of comprehensive diagnosis for soil pollution due to single detection index, complex pre-treatment, and high cost. Compared with traditional chemical methods, the ecotoxicological diagnosis of soil pollution, with high sensitivity, fast response time, combinative detection index, and the unique advantage of reflecting the pollutant stress effect from microscopic view, has become a hot spot in soil pollution diagnosis. In this paper, based on the domestic and foreign literatures, different levels of diagnostic methods based on plants, animals, microorganisms, cells and molecules are presented, the advantages and disadvantages of each method are pointed out, and the prospect is forecasted.

Soil ecotoxicology; Biomarkers; Molecular diagnosis; Omics

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目( ZR2016CB25 )和全國大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃訓(xùn)練項(xiàng)目(201714439007)資助。

ychen0612@163.com)

王開來(1996—)，男，山東棗莊人，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。E-mail：1252235420@qq.com

X53

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.05.003