小細胞肺癌潛在治療靶點研究進展

施甜甜，王玉棟

0 引言

小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）是一種具有高度侵襲性、致死性和廣泛轉移性的肺癌，具有腫瘤生長迅速，血管分布密集，基因組不穩(wěn)定，早期轉移等特點，TP53和RB1普遍失活，并常伴有多個信號通路的改變[1-2]。近年來，臨床前研究模型，包括細胞系，基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models, GEMMs）和患者來源的異種移植物（patient-derived xenografts,PDXs），全基因組測序和NGS等生物技術的發(fā)展大大增加了我們對SCLC分子發(fā)病機制的認識，為改善SCLC診治療效帶來新的曙光[3]。本文將對SCLC的分子發(fā)病機制研究進展進行綜述，探討SCLC基礎和臨床轉化研究的未來方向。

1 SCLC的神經內分泌特征

1.1 SCLC是高級別神經內分泌腫瘤

1968年，Bensch等在SCLC的組織樣本中發(fā)現(xiàn)稀疏微小而致密的核心顆粒，其為神經內分泌（neuroendocrine, NE）細胞的超微結構標志，因此推測SCLC是由肺內NE細胞產生。上世紀60年代，Pearse提出了 “胺前體吸收和脫羧酶”（amine precursor uptake and decarboxylation, APUD）細胞的概念。APUD細胞有分泌低分子量多肽類激素和生物胺的功能，現(xiàn)在被稱為NE細胞。該假設認為所有APUD細胞都來自中神經嵴，而目前研究認為只有一部分NE細胞起源于神經嵴，而另一部分細胞，如肺NE細胞來源于局部多能干細胞。之后研究證明SCLC細胞是具有APUD細胞特性的NE細胞，屬于高級別NE肺癌范疇。

1.2 SCLC神經元轉錄因子

約75%的SCLCs表達細胞存活和生長所必需的轉錄因子acoete-scute同系物1（ASCL1，也被稱為ASH1）[4]。1997年，研究發(fā)現(xiàn)ASCL1是一種可誘導神經元細胞和NE細胞分化的主要調節(jié)因子。ASCL1陽性的SCLC通常表達整套NE標記，ASCL1在神經干細胞中表達。同時ASCL1是譜系特異性癌基因，是高級別NE肺癌的潛在治療靶點。ASCL1的表達與delta-like配體3（DLL3）表達緊密相關（DLL3編碼Notch信號通路的抑制劑），也與RE1沉默轉錄因子（REST）的表達缺失有關（REST可抑制神經元細胞和NE細胞的分化）。約15%的SCLC細胞系和腫瘤細胞表達神經源性分化因子1（NEUROD1），NEUROD1是一種神經元主要調節(jié)因子，通常與ASCL1相關。大多數(shù)SCLC表達ASCL1和/或NEUROD1，有些SCLC兩者均表達或均不表達。ASCL1和NEUROD1作用于NE不同功能的基因位點[4]。若ASCL1失活，NEUROD1未失活，可以阻止基因工程小鼠模型中SCLC細胞的形成[4]。ASCL1還作用于癌基因RET，SRY-box 2（SOX2）和核因子I B（NFIB）以及Notch通路中的多個基因，包括DLL3和DLL1，而NEUROD1作用于MYC。從ASCL1到NEUROD1表達的轉變可能與SCLC “經典”變異亞型有關。在復發(fā)的腫瘤中ASCL1表達的缺失更為常見。由MYC過表達導致基因工程小鼠模型的SCLC細胞經歷了從ASCL1+/NEUROD1-經典亞型到ASCL1-/NEUROD1+變異亞型的快速轉變，從而喪失了NE細胞標記[5]。約15%的SCLC缺乏這些轉錄因子，也不表達NE細胞標記。因此，變異亞型可能并不是由ASCL1基因驅動的，而是由NEUROD1基因驅動，或者二者均不表達[2,4-5]。同源盒蛋白NKX2.1（NKX2-1，也被稱為TTF1）是一種轉錄因子，其表達僅限于腦、甲狀腺和肺。其主要在細支氣管分泌細胞和肺泡Ⅱ型細胞中表達，對于外周肺和支氣管NE細胞的發(fā)育至關重要。TTF1在大多數(shù)肺腺癌中表達，作為譜系特異性的致癌基因發(fā)揮作用。SCLC中TTF1的表達與ASCL1密切相關，可能在NE的分化中發(fā)揮作用。

1.3 腫瘤干細胞與瘤內異質性

腫瘤干細胞（cancer stem cells, CSCs）具有胚胎干細胞的諸多特征，具有高致瘤性，可導致一種或多種高度保守的信號通路的持續(xù)激活，且參與細胞發(fā)育和組織內穩(wěn)態(tài)。Notch、Hedgehog和WNT等通路在SCLC中均可被激活[6]。CSCs生長速度相對緩慢，對常規(guī)治療耐藥后，需尋找新的治療。方法。研究發(fā)現(xiàn)，與NSCLC相比，SCLC中的CSCs大大增加（>所有腫瘤細胞的50%）。呼吸道上皮細胞包含多個干細胞巢，大多數(shù)SCLCs是由干細胞向NE細胞分化產生的[7]。ASCL1（又稱MASH 1）是SCLC細胞系中的一種致癌轉錄因子，在小細胞肺癌CSCs中高表達。最近的研究表明，在小細胞肺癌CSCs表面有Notch配體和ASCL1轉錄靶點DLL3的表達：利用抗體-藥物結合物靶向可能抑制小細胞肺癌細胞生長并阻止腫瘤擴展[8]。在SCLC中，編碼多能干細胞和神經細胞分化的重要轉錄調節(jié)因子SOX2常存在擴增和上調。在SCLC基因工程小鼠模型中，CSC亞群的MYC家族成員存在高表達，特別是MYCL[9]。因此，針對CSCs的潛在治療靶點包括Notch、SOX2和MYC等。

1.4 細胞轉化和瘤內異質性

SCLC可能含有NSCLC成分，通常稱為混合癌[10]。NE細胞由局部多能干細胞分化產生，其有助于我們理解混合癌的概念，也部分解釋了少見的腫瘤轉化現(xiàn)象。目前研究已發(fā)現(xiàn)NSCLC可轉化成SCLC，其基因型和組織學的轉變是酪氨酸激酶抑制劑治療的獲得性耐藥機制之一，具有SCLC特征的轉化腫瘤保留了原始的EGFR突變，并且存在RB1缺失和或TP53突變。對GEMMs的SCLCNSCLC混合癌的研究，證實SCLCs與其他肺部腫瘤有共同起源，且起源于共同的多潛能干細胞或其后代[11]。但值得注意的是，混合腫瘤中具有獨立的SCLC和NSCLC細胞結構，并非轉化而來。

2 SCLC遺傳和分子改變

2.1 煙草與SCLC基因突變

全基因組研究大大提高了我們對SCLC分子發(fā)病機制的認識，并闡明了煙霧致癌物在其病因學中的作用[1]。SCLC和其他與大量吸煙相關的肺癌均具有較高的突變負荷，其中C:G>A:T顛換是最常見的堿基替代形式。研究顯示，APOBEC基因表達是另一個與煙草暴露有關的改變。

2.2 TP53和RB1失活

TP53和RB1基因在SCLC中幾乎全部失活[2]，這是SCLC中必不可少的始發(fā)分子事件。TP53和RB1基因突變通常發(fā)生于大氣道中表達ASCL1的正常NE細胞，也可在其他多能干細胞的次代細胞發(fā)生[7]。GEMMs研究證實，將突變失活的TP53和RB1基因導入小鼠肺內細胞可導致SCLC發(fā)生率陡增，但潛伏期較長（6~12月），且PTEN，NFIB等基因在此期間也會發(fā)生改變[12]。因此，利用這兩種基因的失活可獲得SCLC的GEMMs，且可同時存在一個或多個額外基因的突變[11]。針對INGN-225（P53修飾的腺病毒-轉移的樹突狀細胞疫苗）進行的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗表明，INGN-225可促使機體產生大量的免疫反應（40%~50%）。然而，研究發(fā)現(xiàn)在使用INGN-225后立即接受化療的患者將出現(xiàn)較高的客觀腫瘤復發(fā)率，特別是當出現(xiàn)陽性免疫反應時[13]。而現(xiàn)有的研究表明化療對維持免疫反應是有害的。因此仍需進一步研究。

2.3 染色體3p區(qū)域抑癌基因

1982年Whang-Peng等在細胞遺傳學研究中發(fā)現(xiàn)了SCLC腫瘤細胞和細胞株中頻發(fā)非隨機的獲得性染色體異常（缺失3p）。在所有SCLC中，親本等位基因的缺失幾乎均出現(xiàn)在多個非隨機3p區(qū)域，并且在發(fā)病早期甚至在組織學正常的肺上皮中發(fā)生，反映了普遍存在的癌場效應，進而導致了對于數(shù)個3p區(qū)域的腫瘤抑制基因（TSG）的深入研究。包括Ras相關結構域家族成員1（RASSF1）的異構體（RASSF1A）、透明質酸氨基葡糖苷酶1（HYAL1）、HYAL2，信號素3B （SEMA3B）、SEMA3F、脆性組氨酸三聯(lián)體（FHIT）、環(huán)形交叉軸突導向受體同源物1（ROBO1）和von Hippel-Lindau腫瘤抑制因子（VHL）等表達異常的多個基因和與腫瘤抑制功能有關的蛋白質已被研究證實。但至今對于TSG的確切作用仍知之甚少。

2.4 Notch信號通路

Notch在SCLC中是一種抑癌基因，負向調節(jié)NE的分化。Notch基因在大多數(shù)SCLC中是失活的，特別是在表達全套NE細胞標記基因的SCLC，要么表達DLK1和DLL3，要么Notch通路基因突變失活（約占25%）。相反，在NSCLC中，Notch基因作為致癌基因發(fā)揮功能[14-15]。Notch信號通過轉錄激活HES1、HEY1和其他特定家族成員來維持干細胞活性。Notch信號的激活伴隨著NE分化的喪失，一部分是通過激活編碼神經元和NE分化的轉錄抑制物REST來介導。REST在諸多NSCLC細胞中表達，但在大多數(shù)SCLC細胞中并不表達。因此，在大多數(shù)SCLC中，尤其是那些表達全套NE細胞標記基因的細胞，Notch信號轉導和REST表達均受到抑制。表達Notch的SCLC細胞生長緩慢，這符合Notch的抑瘤基因特點，但耐藥細胞也會表達Notch，這與Notch的致瘤作用一致。非功能性配體DLL3與ASCL1同時表達，并作為Notch信號轉導的主要負向抑制因子發(fā)揮作用。某些DLL3可作為新抗原在SCLC細胞表面表達，但不在正常肺組織中表達。Rovalpituzumab tesirine（ROVA-T）是靶向DLL3的抗體-藥物偶聯(lián)物，在復發(fā)難治性SCLC中顯示出明顯的抗腫瘤活性。在DLL3表達的肺神經內分泌癌Ⅰ期研究中表現(xiàn)出顯著的單藥抗腫瘤活性，據報道，在DLL3高表達的SCLC患者中，ROVA-T的療效高于低DLL3表達的患者。其后續(xù)臨床試驗正在進行[15-17]。VPA（valproic acid）是組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑，可在G1期抑制SCLC細胞的生長和細胞周期阻滯，并降低HDAC4表達，增加組蛋白H4（AcH4）的乙?；?，同時激活Notch信號通路，增加Notch1、Notch靶基因HES1和p21的表達。還觀察到VPA對生長抑素Ⅱ型受體（SSTR2）的表達有很大的促進作用，該受體在許多癌細胞中常被過度表達，并被用作抗癌藥物開發(fā)的靶點，為VPA和靶向SSTR2的細胞毒素的聯(lián)合治療提供了可能[18]。以上研究表明，Notch信號通路在SCLC中的作用非常復雜，并可能提供多種治療靶點。

2.5 MYC家族的作用

MYC家族中包括MYC、MYCL和MYCN三個成員，在SCLC腫瘤細胞中常存在擴增或過度表達，特別是在SCLC變異亞型中。MYC在20%的SCLC中存在擴增，且與患者生存期縮短有關（4周 vs. 26周）。RB1、TP53和p130缺失的肺NE細胞在培養(yǎng)過程中生長并保留全套的NE標記基因，但是沒有致瘤性；而在RB1、TP53和p130缺失的GEMM的癌前NE細胞中，MYC家族成員，特別是MYCL的異常表達在幾周內就會導致腫瘤的形成[19]。而RB1、TP53和p130缺失的SCLC的GEMM中，MYCL的缺失會抑制腫瘤生長，這提示MYCL可能成為MYCL擴增型SCLC的治療靶點。SCLC細胞系中顯性失活“OmoMyc”構建體的外源表達抑制腫瘤細胞生長[20]。Aurora激酶已被確認為是導致SCLC細胞系中MYC家族通路擴增的關鍵激酶。Aurora激酶B（AURKB）使RB基因磷酸化，調控有絲分裂后的檢查點，并預防異常有絲分裂所致的多倍體產生。抑制AURKA和AURKB可選擇性地抑制MYC過表達的SCLC細胞的生長, 并產生多倍體[21]。另外，約6%的SCLC腫瘤細胞中會出現(xiàn)編碼MYC結合蛋白MAX基因的失活，且往往與MYC家族擴增相互排斥。相關研究表明，具有cMYC擴增/高基因表達的SCLC腫瘤經常對Aurora B抑制劑產生反應，臨床研究與預測生物標志物相結合[20]。一項隨機Ⅱ期研究表明，MYC陽性的SCLC腫瘤患者，作為對SCLC的二線治療，在紫杉醇聯(lián)合alisertib可顯著改善PFS[22-23]。

2.6 激酶信號通路

在臨床應用中，EGFR基因突變和EML4-ALK基因融合的肺腺癌患者靶向治療取得了突破性進展，同時促進了在SCLC的激酶基因中尋找靶點的研究。與NSCLC相比，SCLC中激酶基因突變的數(shù)量較少。PI3CA的突變（編碼PI3K的催化亞基）可能在SCLC中發(fā)生，針對PI3K-AKT-mTOR通路的臨床試驗正在進行。PTEN是PI3K-AKT-mTOR途徑的抑制基因，PTEN失活將導致TP53和RB1失活的GEMM的SCLC加速生長和轉移。SCLCs具有激活成纖維細胞生長因子（FGF）-FGF受體1（FGFR1）通路，表現(xiàn)為FGF2、FGF9或FGFR1蛋白和（或）mRNA等表達和擴增。FGFR1蛋白的表達與FGFR1 mRNA水平和FGFR1基因拷貝數(shù)相關。針對FGFR1和配體表達的研究顯示可能選擇靶向FGFR1抑制劑治療SCLC患者。與NSCLC相反，EGFR或KRAS突變，以及EGFR或KRAS其他信號的干擾，包括下游的RAF-MEK-ERK通路的突變，在SCLC中極為罕見。實際上在SCLC中從未發(fā)現(xiàn)KRAS突變，該通路失活可能對SCLC有利[24]。

3 SCLC的表觀遺傳變化

盡管在SCLC中發(fā)現(xiàn)大量的DNA序列改變，但表觀遺傳學改變在SCLC發(fā)病中起著至關重要的作用。表觀遺傳變化可影響許多基因，這些變化對腫瘤生長有害也有利，靶向特定的表觀遺傳學改變可能會為SCLC帶來更多獲益[25]。

3.1 DNA甲基化和EZH2

至今仍缺乏對SCLC全基因甲基化的研究，且相關報道較少。一項全甲基化研究發(fā)現(xiàn)，在非惡性肺組織和SCLC腫瘤組織、異種移植組織和細胞系之間，DNA甲基化模式存在相當大的差異，異種移植更能代表腫瘤中發(fā)現(xiàn)的基因突變模式[26]。經典和變異亞型的SCLC具有不同的甲基化模式，尤其是影響神經分化基因。重要的表觀遺傳沉默基因包括NEUROD1、REST、轉錄因子2（TCF2，也稱為HNF1B）、視黃酸受體β（RARB）和BCL2以及許多位于3p染色體上的基因，包括RASSF1A和zeste homologue 2（EZH2）的基因編碼增強因子。EZH2是轉錄的主要調節(jié)因子，可通過上調DNA甲基轉移酶影響DNA甲基化。其在許多惡性腫瘤中被上調，并與不良預后有關。EZH2過表達可抑制TGFβ-SMAD通路甲基化，而使ASCL1失活，進而導致SCLC進展。因此，EZH2已成為治療SCLC的熱門靶點。EZH2抑制劑，如GSK-126、tazemetostat和CPI-1205，以及參與染色質重組的靶標EZH2，均被設計用來開發(fā)合成藥物[16]。

3.2 染色質修飾

染色質模型獲取濃縮基因組的DNA，從而保證轉錄過程。SCLC亞組可發(fā)生編碼結構相似的組蛋白修飾物EP300和CREBBP的互斥突變，或編碼相關組蛋白甲基轉移酶的KMT2A和KMT2D的互斥突變[27]。含溴結構域和外部結構域（BET）可調控MYC的表達，且BET在MYC家族擴增的SCLC細胞系中表達更高。目前，幾種BET抑制劑正在進行SCLC早期臨床試驗。EZH2在SCLC中經常過表達，而并不突變，可導致DNA甲基化改變。EZH2主要通過維持干細胞活性、抑制細胞凋亡、提高細胞增殖、抑制ASCL1表達（通過抑制TGFβ信號轉導）和誘導化療耐藥（通過抑制SLFN11）等機制在SCLC中發(fā)揮作用，已成為腫瘤治療的優(yōu)選靶點。

3.3 超增強子和染色質重塑和轉錄

染色質修飾和轉錄因子占據超增強子導致轉錄增加。SCLC譜系關鍵的轉錄因子ASCL1和NEUROD1的基因位于SCLC細胞系的超增強子的活性染色質區(qū)域[19]。而超增強子也與已知的SCLC癌基因有關，如MYCL、MYC、NFIB和BCL2。Faber等臨床前的研究表明，BCL2蛋白家族促凋亡成員BIM的表達水平可能預測機體對ABT-263（誘導細胞凋亡的BH3模擬劑）的敏感度[28]。抑制BET基因組中BRD4或cyclin依賴性激酶CDK7的活性，將阻斷與超增強子有關的NE譜系特異性基因和MYC的表達，這也提供了潛在的治療靶點[19]。

3.4 NFIB和腫瘤轉移

NFIB是一種編碼胚胎肺和大腦發(fā)育所必需的轉錄調節(jié)因子，同時也是一種與癌癥發(fā)生、進展、侵襲和轉移相關的驅動性癌基因，在SCLC中存在過表達和擴增[27,29-30]。與原發(fā)腫瘤相比，NFIB在轉移腫瘤中往往是擴增和過表達的，且與低分化的鈣粘蛋白1（CDH1）陰性表達的亞組有關。由于NFIB表達能重新配置遠端調控位點的染色質開放區(qū)域，使其更容易訪問，因此NFIB表達在SCLC轉移過程中發(fā)揮重要作用[31]。

綜上所述，SCLC是一種具有高度侵襲性的癌癥，其特征在于快速增殖，多信號通路失調，血管豐富，凋亡失衡和遺傳不穩(wěn)定性。未來針對SCLC的臨床轉化性研究和靶向Notch、SOX2、MYC和EZH2等靶點的新型藥物的臨床試驗結果值得期待。