體外血腦屏障模型的研究進(jìn)展及其在新藥研發(fā)中的作用

王伯松 郭安臣 王 群

（1 哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2 北京腦重大疾病研究院，北京 100069；3 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100050；3 國(guó)家神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100076；5 腦血管病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100076）

血腦屏障（brain-blood barrier，BBB）是腦毛細(xì)血管阻止某些物質(zhì)（多半是有害的）進(jìn)入腦循環(huán)血，從而保持腦組織內(nèi)環(huán)境的基本穩(wěn)定的一種基本結(jié)構(gòu)。從生物學(xué)和功能角度來看，BBB在維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)锽BB功能的惡化會(huì)誘發(fā)或加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。相反，BBB阻礙有害物質(zhì)的同時(shí)也阻礙了治療大腦內(nèi)多種神經(jīng)疾病的靶向藥物。本文即通過血腦屏障模型建立的研究進(jìn)行綜述。

1 血腦屏障的結(jié)構(gòu)

血腦屏障（BBB）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能所必需的擴(kuò)散屏障。BBB的內(nèi)皮細(xì)胞與身體其他部位的內(nèi)皮細(xì)胞不同，他們的細(xì)胞質(zhì)厚度均勻，沒有開窗而且具有更廣泛的緊密連接（TJs）以及少量的吞飲囊泡。內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接限制親水分子穿過BBB的細(xì)胞旁通路。相反，小的親脂性物質(zhì)，如O2和CO2則可以沿著它們的濃度梯度通過自由擴(kuò)散穿過質(zhì)膜進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)內(nèi)[1-2]。葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)素通過轉(zhuǎn)基因蛋白進(jìn)入大腦，而像胰島素、瘦素和鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白等更大分子的攝取則通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[3-5]。除了內(nèi)皮細(xì)胞以外，BBB的組成成分還包括毛細(xì)血管基底膜（BM），星形膠質(zhì)細(xì)胞的末端，足細(xì)胞以及包埋在BM內(nèi)的周細(xì)胞（PC）組成?；讓佑裳苤車男切文z質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，它具有包括細(xì)胞黏附和遷移的機(jī)械支持，以及跨細(xì)胞受體（整聯(lián)蛋白）建立連接細(xì)胞的細(xì)胞骨架元素到細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）橋梁的功能[6]。這層基底層還調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的溝通，是血管系統(tǒng)和大腦之間的另一個(gè)大分子障礙通道[7]。周細(xì)胞是BBB結(jié)構(gòu)中細(xì)胞成分最少的部分，但在血管結(jié)構(gòu)完整性及分化，和內(nèi)皮緊密連接的形成中起至關(guān)重要的作用[8]。由此看來，BBB的所有組成成分對(duì)于BBB正常功能和穩(wěn)定性都是必不可少的。

2 血腦屏障模型的建立

2.1 利用Transwell建立體外BBB模型：這是最簡(jiǎn)單可行也是最常見的體外BBB模型。在靜態(tài)系統(tǒng)培養(yǎng)條件下，將單層腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞EC接種在可滲透的支架上。在Transwell小室中，將允許溶質(zhì)通過的微孔半滲透的支架置于細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞接種在支架底部，使其在滲透膜之間通過[9-10]。這種BBB模型允許內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行遷移。已經(jīng)有大量的動(dòng)物以及人的腦血管EC用于建立血腦屏障體外模型。雖然這種模型比較穩(wěn)定，成本也比較低，但是缺乏相鄰細(xì)胞群之間的信號(hào)傳導(dǎo)，如星形膠質(zhì)細(xì)胞以及周細(xì)胞，和機(jī)械性刺激的致敏性調(diào)節(jié)，如剪切應(yīng)力。這就很大限度的限制了長(zhǎng)期維持BBB模型特性的能力[11]。

因此在這個(gè)模型的基礎(chǔ)上建立了更加復(fù)雜的共培養(yǎng)系統(tǒng)來進(jìn)一步完善BBB模型。其中被使用最廣泛的就是星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，因?yàn)樾切文z質(zhì)細(xì)胞在血腦屏障細(xì)胞群緊密發(fā)展中起至關(guān)重要的作用。最常見的方法之一，是將ECs接種在微孔濾膜的上層，而將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種在下層，雖然這樣可以使兩種細(xì)胞直接接觸，但是高于體內(nèi)的厚度使細(xì)胞間的作用力受到了限制。另一種方法是將星形膠質(zhì)細(xì)胞在容器底部培養(yǎng)，使釋放的因子通過擴(kuò)散透過濾膜與內(nèi)皮細(xì)胞相接觸。還有一種方法是將神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞與周細(xì)胞三種細(xì)胞群共培養(yǎng)的BBB模型。將ECs接種在微孔濾膜的上層，下層接種星形膠質(zhì)細(xì)胞，在容器底部接種神經(jīng)元。也有研究將星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞混合接種在容器底部來進(jìn)行試驗(yàn)[12]。這種添入神經(jīng)元的共培養(yǎng)系統(tǒng)所形成的BBB模型，在某種程度上可以對(duì)藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響進(jìn)行評(píng)估。但由于共培養(yǎng)系統(tǒng)所形成的環(huán)境較為復(fù)雜，使得可管理性大大降低。

2.2 永生化內(nèi)皮細(xì)胞系建立BBB模型：目前許多研究開發(fā)了不同來源的永生化內(nèi)皮細(xì)胞系，但卻只有少數(shù)能夠表達(dá)BBB在體內(nèi)的功能和特性。在最近的研究中，Rahman等[13]共統(tǒng)計(jì)了36種利用永生化內(nèi)皮細(xì)胞所建立的BBB模型。其中人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3，大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系RBE4和小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3是被用來建模次數(shù)最多的三種細(xì)胞系。這種細(xì)胞系建立的模型能夠有效地體現(xiàn)較多BBB的EC特性，使得體外的BBB模型更具有人的特性。這個(gè)細(xì)胞系能夠保持體內(nèi)的內(nèi)皮表型，包括許多受體以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，直至幾十代[14-15]。在使用該細(xì)胞系的時(shí)候，可以通過將其與周細(xì)胞或是星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的方式來改善BBB屏障的緊密度[16]。

大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞系RBE4在BBB建模中表現(xiàn)出較好的特性，但其缺乏形成TJ的復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性較高，限制了其在CNS藥物分布檢測(cè)中的應(yīng)用。小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3和bEnd.5在商業(yè)的利用比較廣泛，其中細(xì)胞系bEnd.3的模型由于TJ蛋白水解蛋白-5，閉合蛋白以及緊密連接蛋白ZO-1的高水平表達(dá)表現(xiàn)出比bEnd.5更加緊密的屏障[17]。bEnd.3細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，低細(xì)胞旁通透性以及可以保留數(shù)代的內(nèi)皮表型，使其建立的BBB模型更具開發(fā)性[17]。

2.3 通過3D細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）建立BBB模型：通過使用一種細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與同質(zhì)的細(xì)胞群，如星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞及微血腦管所共組建的2D培養(yǎng)物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。但是這種2D培養(yǎng)物所建立的BBB模型只能將細(xì)胞培養(yǎng)限制在平面環(huán)境中。而最近幾年出現(xiàn)了三維球體、三維水凝膠以及ECM和固體支架所建立的3D培養(yǎng)模型[18-19]。其中Chrobak等[20]就是通過建立這種三維細(xì)胞培養(yǎng)的方法來產(chǎn)生微血管，以此來研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞和上皮生理學(xué)。他們使膠原凝膠形成一個(gè)圓柱形通道，在其中融合了人的單層ECs，再將血管周細(xì)胞加入其中，也可以等到EC細(xì)胞生長(zhǎng)到可融合后加入。但是這個(gè)模型缺乏剪切應(yīng)力以及因?yàn)閿U(kuò)散等因素所造成的外部刺激。

Ⅰ型膠原通常被選作為細(xì)胞外基質(zhì)來建立體外模型。膠原蛋白作為從各種生物資源中分離出來的天然水凝膠，它不但可以與整聯(lián)蛋白受體相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)外，還可以支持三維細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化[21]。目前已經(jīng)有許多研究將其應(yīng)用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、炎癥作用以及藥物毒性和腫瘤細(xì)胞的侵襲中[22-24]。聚-D-賴氨酸或是基質(zhì)膠也可以選做細(xì)胞外基質(zhì)來建立模型。其中基質(zhì)膠可以形成厚而松散的交聯(lián)凝膠，能夠促進(jìn)3D組織的生長(zhǎng)。相比之下，膠原蛋白和層粘連蛋白則能夠自發(fā)形成3D凝膠且具有固有的自發(fā)聚合能力。當(dāng)然這種3D微環(huán)境也存在著許多缺陷。例如在培養(yǎng)ECs時(shí)，氧氣、營(yíng)養(yǎng)以及可溶性的生長(zhǎng)因子的分布在整個(gè)培養(yǎng)層中是不均勻的，而且凝膠會(huì)隨著介質(zhì)的擴(kuò)散出現(xiàn)梯度。而天然水凝膠的提取是從動(dòng)物中分離出來，存在著組合后的變異性。合成水凝膠是由純非天然分子所組成，這些分子具有生物惰性，并能夠產(chǎn)生明確的3D微環(huán)境。其制作簡(jiǎn)單，方便適應(yīng)機(jī)械力，且重現(xiàn)性高。希望在不久的將來能夠出現(xiàn)具有天然水凝膠和合成水凝膠組合特性的ECM，以此來應(yīng)對(duì)不同的3D微環(huán)境所導(dǎo)致不同的細(xì)胞反應(yīng)。

2.4 微流體組織裝置建立BBB模型：微流體組織裝置是近年來受到較多關(guān)注的一個(gè)模型，有研究將其加入BBB模型的建造中，以此能夠判斷剪切應(yīng)力對(duì)BBB的影響[25]。它將微工程技術(shù)與活細(xì)胞群體結(jié)合起來，較好的體現(xiàn)體內(nèi)環(huán)境的組織特征，包括空間定義的共培養(yǎng)物和極化細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。在一個(gè)設(shè)計(jì)好的芯片方案中，通過使用“軟光刻技術(shù)”將彈性體材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）模塑成光定義的母模來制造微流體通道[26]。然后將多孔細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)（大多是聚酯或聚碳酸酯膜或薄的穿孔的PDMS膜）密封在通道網(wǎng)絡(luò)之間[27-28]。這些通道使得膜的只有一側(cè)能夠通過，并將一些細(xì)胞群引入并附著在通道中。該裝置能夠維持細(xì)胞流動(dòng)并不影響細(xì)胞增殖，施加剪切應(yīng)力的同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)合并建立極化組織。這種組織裝置在過去的研究中已經(jīng)成功地建立包括肺、腸以及脈管系統(tǒng)等屏障模型[29]。

邵曉劍等[30]構(gòu)建了一個(gè)微流控芯片平臺(tái)以模擬血腦屏障，他將平臺(tái)分為三個(gè)模塊：血腦屏障模型，包括中間夾有半透膜且上下交叉的直通道；三維細(xì)胞培養(yǎng)室，用于細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，微固相萃取柱芯片，用作樣品進(jìn)入質(zhì)譜分析前的除鹽和富集。實(shí)驗(yàn)測(cè)得的三維培養(yǎng)的腦組織細(xì)胞模型可進(jìn)一步評(píng)測(cè)藥物在腦部組織中的擴(kuò)散和藥效，藥效結(jié)果也更接近體內(nèi)數(shù)據(jù)。Brown等[31]將3D凝膠直接結(jié)合到微流體結(jié)構(gòu)中來創(chuàng)建神經(jīng)血管單元NVU。他將底部灌注通道從腦室與多孔膜分離，一端培養(yǎng)ECs，另一端培養(yǎng)周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞。然后將腦室用人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的神經(jīng)元3D膠原Ⅰ凝膠填充。頂部灌注通道用來維持腦室的細(xì)胞活力。TEER測(cè)量的結(jié)果在細(xì)胞培養(yǎng)的12天內(nèi)顯著增加，內(nèi)皮TJs的ZO-1染色，以及減少的FITC-綴合葡聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)都可以證明屏障功能。

Herland等[32]采用“黏性指法”的方法在微流體的通道內(nèi)建立了一個(gè)圓柱形的膠原凝膠[33]。為將聚合前膠原體的中心除去，在通道內(nèi)充滿膠原蛋白和可控的流動(dòng)流體。然后將人的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞包埋在大塊的凝膠中，并依次將人的皮質(zhì)周細(xì)胞和微血管內(nèi)皮層細(xì)胞附襯在內(nèi)腔表面，以此來創(chuàng)建神經(jīng)血管單元NVU。這種方法成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生理結(jié)構(gòu)，并通過VE-鈣黏蛋白和ZO-1染色驗(yàn)證了內(nèi)皮單層及TJ的存在。這種方法還可以進(jìn)一步用來探索NVU炎癥的特性。

2.5 基于干細(xì)胞建立BBB模型的進(jìn)展：以動(dòng)物為來源所建造的BBB模型已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，但由于物種的差異使得其不能夠在臨床神經(jīng)科學(xué)和藥物的開發(fā)上得以應(yīng)用[34]。而分離原代人腦EC的有限性及高額的成本使得應(yīng)用人的BBB體外模型的研究受到了阻礙[35]。而作為原代培養(yǎng)替代物的永生化人BBB內(nèi)皮細(xì)胞系卻具有單層完整性及較低的TJ蛋白表達(dá)。因此，在神經(jīng)血管研究的領(lǐng)域開發(fā)出能夠更加模擬出人體內(nèi)環(huán)境的BBB模型仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

近幾年對(duì)于干細(xì)胞的研究有了新的科學(xué)進(jìn)展，這使得研究該方面的各種人類疾病和有關(guān)藥物的研究提供了新的研究途徑[36-40]。多能干細(xì)胞和成體干細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的自我更新能力，并且可以獲得任何特定的細(xì)胞表型[41-42]。而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）或胚胎干細(xì)胞（ESC）的開發(fā)也已經(jīng)被用于建造體外人BBB模型[43-44]。同樣人的臍帶造血祖細(xì)胞也被人們用來建造體外人BBB模型。Ponio等[45]曾在星形膠質(zhì)細(xì)胞存在的情況下，使用臍帶血干細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞集中定向誘導(dǎo)，產(chǎn)生了類似于hCMEC/D3細(xì)胞系的單層完整性的BBB模型性質(zhì)。而與周細(xì)胞共培養(yǎng)的來源于造血干細(xì)胞的ECs所建立的BBB模型則顯示出具有功能性和成熟性的反應(yīng)，并具有持續(xù)性的屏障緊密性[46]。與其他的體外BBB模型相比，這種模型的穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于那些屏障緊密性差的模型。

對(duì)于原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分離的難題，使得胚胎及人腦神經(jīng)元祖細(xì)胞（NPC）成為了建立體外穩(wěn)定血腦屏障模型的潛在選擇[47-48]。因?yàn)槿四X神經(jīng)元祖細(xì)胞（NPC）能夠廣泛增殖并可以分化出神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞譜系，而這些譜系是BBB在體內(nèi)發(fā)育和成熟的關(guān)鍵[48]?；谌祟怭SC的BBB模型建立的研究，Stebbins等[44]對(duì)使用各種hiPSC細(xì)胞系和優(yōu)化人源化BBB模型方面的開發(fā)取得了很大的進(jìn)展。該過程涉及hiPSC黏附培養(yǎng)未成熟的NPCs和EPC的分化，然后對(duì)EC基質(zhì)的規(guī)格選擇和純化。純化后的BMECs表現(xiàn)出細(xì)胞間輪廓的富集TJ蛋白的表達(dá)以及各種具有功能性的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的極化表達(dá)。主要在于周細(xì)胞被視黃酸處理后調(diào)節(jié)IMR90-c4衍生的BMEC單層，可與分化的人的NPC共培養(yǎng)使得BBB表型富集。而除了視黃酸外，用于早期維持干細(xì)胞的基質(zhì)源與分化前的初始hPSC接種密度，也顯著影響B(tài)MEC的數(shù)量及BBB的緊密度。由此可見，hPSC衍生的BBB模型具有潛在的可能性作為可靠的藥物篩選工具[49]。雖然可能需要更多的化合物來對(duì)此進(jìn)行測(cè)試，但不可否認(rèn)的是其利用前景。而且還可以將干細(xì)胞與微流體方法相結(jié)合，來開發(fā)用于高通量研究的更穩(wěn)定強(qiáng)大的BBB模型平臺(tái)。

2.6 以3D打印技術(shù)建立BBB模型：到目前為止，3D打印技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于復(fù)制人的皮膚、骨骼以及耳朵和肝臟等人體器官[50]，也被應(yīng)用于創(chuàng)造灌注功能性的血管通道[51]。這種3D打印技術(shù)，包括平版印刷文件的打印是通過計(jì)算機(jī)斷層掃描或是磁共振成像捕獲的二維圖像的層析重建所創(chuàng)造的。由于NVU具有很大的復(fù)雜性，使其在腦血管中的應(yīng)用受到了很大限制，建立BBB模型的復(fù)雜環(huán)境還有待開發(fā)。

3 新藥研發(fā)在BBB模型中的進(jìn)展

新藥研發(fā)與人類健康息息相關(guān)，能夠促進(jìn)人類衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展和進(jìn)步[52]。中樞靶向藥物在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病，腦腫瘤以及阿爾茨海默病等疾病的難點(diǎn)就是在于血腦屏障的阻礙。而克服血腦屏障即成為了藥物研發(fā)成功的關(guān)鍵所在[53]。

針對(duì)緊密連接，有研究人員通過高滲作用使腦內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞暫時(shí)脫水而產(chǎn)生收縮，導(dǎo)致細(xì)胞體積變小間距變寬，進(jìn)而通過被動(dòng)擴(kuò)散將藥物帶入腦內(nèi)[54]。Cote等[55]則通過合成緩激肽及類似物能夠破壞BBB通透性的特性，應(yīng)用了兩種新型強(qiáng)效BK激動(dòng)劑，單用或合用來改變BBB的通透性，來提高藥物生物利用度。Kim等[56]發(fā)現(xiàn)通過腺苷受體信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制能夠影響細(xì)胞骨架分子，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞形狀發(fā)生改變，使得緊密連接開放，BBB的通透性提高。針對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，P-gp作為能夠識(shí)別和外排異源物的底物，成為了藥物進(jìn)入腦內(nèi)一道難以逾越的障礙。使用相應(yīng)的抑制劑，雖減少其抑制的功能，但臨床效果并不佳[57]。而通過溶質(zhì)載體，可幫助分子穿過細(xì)胞屏障，其中Ronaldson等[58]發(fā)現(xiàn)通過TGF-β/ALK5信號(hào)通路上調(diào)作用，能夠使Oatpla4相應(yīng)的底物增加攝取量，以此來作為潛在的靶點(diǎn)，對(duì)BBB內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能性表達(dá)進(jìn)行精確的控制，引導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至腦內(nèi)。針對(duì)定點(diǎn)釋放藥物，如今聚集超聲應(yīng)用熱和力學(xué)機(jī)制，非集中性的集中到身體內(nèi)部，能夠產(chǎn)生廣泛的生物效應(yīng)，目前有些外科手術(shù)嘗試應(yīng)用于腦部的非入侵性消融治療[59]。Hirschberg等[60]使用外源性或內(nèi)源性光敏劑，采用成功可逆開放選定區(qū)域的BBB，實(shí)現(xiàn)了遞送藥物和MRI對(duì)比劑的目的。對(duì)于血腦屏障以及作用藥物的研究還在不斷的進(jìn)行中，更深入了解轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)和發(fā)掘新型的神經(jīng)系統(tǒng)藥物，還需我們更加深入的探索。

4 現(xiàn)狀與展望

血腦屏障在腦內(nèi)缺乏開窗，以限制外源性物質(zhì)的進(jìn)入，從而起到對(duì)腦部神經(jīng)中樞保護(hù)的作用。NVU細(xì)胞之間的相互作用及影響是對(duì)BBB功能的形成及維持至關(guān)重要的。隨著生物技術(shù)的不斷進(jìn)步以及人們研究的不斷深入，在體外建立BBB模型方面的研究也從細(xì)胞間通過Transwell共培養(yǎng)所建立簡(jiǎn)單的體外BBB模型，到通過永生化細(xì)胞系、微流體裝置以及3D細(xì)胞外基質(zhì)等方法來使得BBB模型更加復(fù)雜并具有功能性，更加貼近體內(nèi)環(huán)境的同時(shí)且能夠維持更久的屏障功能。使得人們?cè)诳蒲械缆飞先〉眯碌倪M(jìn)展的同時(shí)，也為研究腦內(nèi)相關(guān)疾病及藥物研發(fā)的工作者提供了新的線索。