藥物檢驗(yàn)分析中應(yīng)用超高效液相色譜法的研究

張愛芳

（濱州市濱城區(qū)市場監(jiān)督管理局，山東 濱州 256600）

超高效液相色譜法是一種高速有效的分析分離技術(shù)，在藥物檢驗(yàn)分析領(lǐng)域中的應(yīng)用十分廣泛。為了進(jìn)一步分析超高效液相色譜法在藥物檢驗(yàn)分析中的應(yīng)用價(jià)值及優(yōu)勢(shì)，本研究選取藥物三七傷藥片作為研究對(duì)象，分別應(yīng)用超高效液相色譜法和高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，將兩種方法的平均分析時(shí)間和徹底分離率進(jìn)行對(duì)比。現(xiàn)具體報(bào)道如下。

1 儀器與方法

1.1 儀器：超高效液相色譜儀；液相色譜儀；三七傷藥片（西安阿房宮藥業(yè)股份有限公司；國藥準(zhǔn)字Z61021267）48片。

1.2 方法：將三七傷藥片48片平均分層均等的2份，其中1份采用超高效液相色譜法檢驗(yàn)，另外1分采用高效液相色譜法檢驗(yàn)。超高效液相色譜法：將藥片研磨至粉末狀，對(duì)粉末加流動(dòng)溶解，經(jīng)稀釋和濾過后吸收20 μL稀釋液注入超高效液相色譜儀，觀察并記錄色譜圖。高效液相色譜法：將藥片研磨至粉末狀，藥粉置入50 mL量瓶中加流動(dòng)溶解，經(jīng)稀釋和濾過后，放入200～400 nm紫外線中掃描，末端吸收210 nm，檢測(cè)波長，吸取20 μL稀釋液注入液相色譜儀，觀察并記錄色譜圖。

2 指標(biāo)與數(shù)據(jù)處理

2.1 觀察指標(biāo)：分析超高效液相色譜法和高效液相色譜法不同方法下的藥物檢驗(yàn)分析時(shí)間和徹底分離率。

2.2 數(shù)據(jù)處理：所有研究數(shù)據(jù)帶入SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料的比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較進(jìn)行對(duì)比χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

采用超高效液相色譜法的藥片平均分析時(shí)間為（2.41±0.22）min，采用超高效液相色譜法的藥片平均分析時(shí)間為（15.25±2.65）min，兩組對(duì)比差異顯著，t=8.4471，P＜0.05；采用超高效液相色譜法的徹底分離率為100%（24/24），采用高效液相色譜法的徹底分離率為79.17%（19/24），兩組對(duì)比差異顯著，χ2=7.3419，P＜0.05。

4 討 論

4.1 超高效液相色譜法的發(fā)展及優(yōu)勢(shì)：液相色譜是現(xiàn)代色譜技術(shù)中應(yīng)用最廣泛、最活躍的分析方法之一，廣泛用于環(huán)境、生化、食品、農(nóng)業(yè)、藥物等多個(gè)領(lǐng)域的分析。伴隨工業(yè)進(jìn)展與科技進(jìn)步，各個(gè)領(lǐng)域?qū)σ合嗌V的要求不斷提高，大批量樣品分析要求在短時(shí)間內(nèi)完成，一些生化樣品、天然產(chǎn)物的分析對(duì)液相色譜技術(shù)的分離能力提出了更高的要求，與其他技術(shù)聯(lián)用對(duì)檢測(cè)器提出了更高的要求。在這種情況下，基于小顆粒填料的液相色譜技術(shù)——超高液相色譜應(yīng)運(yùn)而生。超高效液相色譜法是一種新型的高效液相色譜技術(shù)，伴隨這一技術(shù)的研發(fā)成功與廣泛應(yīng)用，液相色譜技術(shù)的分離能力得到了快速提高，色譜分析技術(shù)也隨之進(jìn)入了一個(gè)新領(lǐng)域。因超高效液相色譜法具有樣品組分易吸收、樣品處理簡便、檢測(cè)自動(dòng)化、檢測(cè)靈敏度高、藥物分離效率高等優(yōu)勢(shì)，常用于藥物質(zhì)量檢驗(yàn)、微量藥物檢驗(yàn)、藥劑樣品檢驗(yàn)、藥品成分識(shí)別等[1]。超高效液相色譜法的原理在于采用超高壓和亞2 μm小顆粒填料技術(shù)，提高了色譜柱的性能、分離檢測(cè)速度和靈敏度，縮短了樣品分析的時(shí)間[2]。

超高效液相色譜法的理論基礎(chǔ)為范德米特方程，HETP=AdP+B/v+CdP2v，其中HETP代表理論塔板高度，AdP 代表渦流擴(kuò)散體系×填料粒徑，B/v代表分子鏡像擴(kuò)散系數(shù)÷流動(dòng)相線速度，CdP2v代表傳質(zhì)因子×填料粒徑×2×流動(dòng)相線速度。根據(jù)范德米特方程可知顆粒度越小，柱效越高，檢測(cè)速度越快。在理論上超高效液相色譜法與高效液相色譜法的原理基本相同，但與高效液相色譜法相比，超高效液相色譜法增加了分析通量、色譜峰容量、靈敏度，彌補(bǔ)了高效液相色譜法的不足，在檢測(cè)靈敏度、分析速度、分離度等方面具有更明顯的優(yōu)勢(shì)。在適應(yīng)環(huán)境方面，超高效液相色譜法對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力更佳，高壓、高速環(huán)境下，能夠高效完成樣品分離，且樣品分離質(zhì)量較好。在靈敏度方面，超高效液相色譜法采用的微粒，能夠減小顆粒度粒徑和微粒色譜峰，縮短樣品化合物離子化、樣品基質(zhì)雜志分離時(shí)間，提高檢測(cè)的靈敏度[3]。在分析速度方面，超高效液相色譜法采用的微粒使色譜柱長明顯縮短，在柱效保持不變的情況下，藥物分析速度大大提升分析，縮短了藥物分析的時(shí)間，提高了藥物分析的效率[4]。

4.2 超高效液相色譜法在藥物檢驗(yàn)分析中的應(yīng)用：在藥物檢驗(yàn)分析中，有時(shí)樣品含量較少，進(jìn)行分離難度較大，花費(fèi)時(shí)間較長。迫切需要一種分析速度快、分離效率高的技術(shù)。超高效液相色譜法能夠滿足這一要求，并具有高靈敏度、高精確度的特點(diǎn)，故在藥物檢驗(yàn)分析中獲得十分廣泛的應(yīng)用。因?yàn)槌咝б合嗌V法分辨率高、重復(fù)性好、檢測(cè)速度快、自動(dòng)化程度高等優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)藥品含量中，應(yīng)用超高效液相色譜法檢測(cè)抽檢樣品，能夠有效規(guī)避假冒偽劣藥品等不法行為，進(jìn)一步保障用藥安全。在常規(guī)藥物分析中，超高效液相色譜法的最終分析結(jié)果可以達(dá)到美國食品和藥品管理局在精度、準(zhǔn)確度方面的要求。大量臨床研究實(shí)踐表明，超高效液相色譜法與高效液相色譜法相比具有更高的分離能力，而且解決了藥物檢驗(yàn)分析領(lǐng)域在速度與分離度之間進(jìn)行取舍的難點(diǎn)。使用超高效液相色譜法能夠在很快的線速度、流速、反壓下進(jìn)行高效分離，并且能夠獲得優(yōu)異的結(jié)果。超高效液相色譜法可用于原料藥、中間體、成藥中各組分與各雜質(zhì)的含量檢測(cè)，并且快速、準(zhǔn)確、可靠。近年來在《中國藥典》中采用超高效液相色譜法檢測(cè)的項(xiàng)目逐漸增多，可以預(yù)見未來超高效液相色譜法會(huì)獲得更快速的發(fā)展，逐步成為藥物含量測(cè)定的主流分析方法。

在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中，檢查“有關(guān)物質(zhì)”是重要的項(xiàng)目之一。因藥品在生產(chǎn)過程中的各環(huán)節(jié)均會(huì)產(chǎn)生一些相關(guān)物質(zhì)，存在雜質(zhì)會(huì)影響藥品的安全性，故藥品檢驗(yàn)中需要對(duì)藥品“有關(guān)物質(zhì)”含量進(jìn)行控制。藥品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)中產(chǎn)生的雜質(zhì)含量普遍微小，甚至可以忽略不計(jì)，采用薄層色譜法等常規(guī)方法很難準(zhǔn)確且靈敏的檢測(cè)到“有關(guān)物質(zhì)”，通過超高效液相色譜法具有快速、準(zhǔn)確、便捷、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，能夠同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)中多種雜質(zhì)，成為檢測(cè)藥品“有關(guān)物質(zhì)”的新型方法。在藥物鑒別中，保留時(shí)間與組分結(jié)構(gòu)、性質(zhì)存在較大關(guān)聯(lián)，能夠作為定性參數(shù)之一。將供品、對(duì)照品的保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間的一致性進(jìn)行對(duì)比，鑒別藥物可有效排除因輔料干擾而得出的不合理結(jié)論，且重復(fù)性較好，為完善、開發(fā)藥物鑒別的方法提供了一種新思路。

盡管超高效液相色譜法能夠顯著減少復(fù)雜樣品分析分離時(shí)間，提高分離度和檢測(cè)靈敏度，但超高效液相色譜法在藥物檢驗(yàn)分析中的應(yīng)用仍存在一定局限性，大范圍的應(yīng)用普及仍然需要一些時(shí)間。超高效液相色譜法是應(yīng)亞2 μm小顆粒填料技術(shù)需求專門設(shè)計(jì)的耐高壓液相色譜系統(tǒng)，使用小粒徑填料的色譜柱能夠最大限度的發(fā)揮超高效液相色譜法高靈敏度、高分離度的優(yōu)勢(shì)，但要求色譜柱能夠耐受小粒徑帶來的高反壓，粒徑減少對(duì)色譜柱的充填技術(shù)提出了更高的要求，超高效液相色譜儀開發(fā)商也只能提供有限型號(hào)的色譜柱。目前各大企業(yè)已經(jīng)在努力開發(fā)小粒徑填料色譜柱，相信隨著色譜填料技術(shù)的不斷發(fā)展，會(huì)有更多的色譜柱能夠發(fā)揮小粒徑填料的優(yōu)勢(shì)，超高效液相色譜法色譜柱型號(hào)缺乏問題會(huì)得到有效克服。有研究表明，超高效液相色譜法在進(jìn)行樣品分析時(shí)的峰面積重復(fù)性較高效液相色譜法差，在低濃度樣品分析時(shí)這種情況更為明顯。有研究表明應(yīng)用超高效液相色譜法檢測(cè)低濃度樣品時(shí)，其精密度和準(zhǔn)確度均較差。這種情況可能與檢測(cè)儀器探測(cè)頻率較低有關(guān)。伴隨超高效液相色譜法的開發(fā)和應(yīng)用，相信超高效液相色譜儀也會(huì)得到進(jìn)一步發(fā)展。

但超高效液相色譜法作為一種新型液相色譜技術(shù)，延伸了液相色譜的應(yīng)用范圍，以超強(qiáng)的分離能力、分析速度、高靈敏度、簡單方便的操作為現(xiàn)代色譜分析開創(chuàng)了更廣闊的應(yīng)用前景。超高效液相色譜法進(jìn)樣體體積小、分離速度快、溶劑消耗少，為藥物化學(xué)成分分析、藥物合成分析、中藥定性定量分析、藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析等提供了更為高效、準(zhǔn)確的分析技術(shù)。利用超高效液相色譜法的高分離效率、高靈敏度和定性功能，能夠快速完成許多復(fù)雜成分的分離、鑒定。本研究采用超高效液相色譜法和高效液相色譜法進(jìn)行藥物檢驗(yàn)分析，研究結(jié)果提示采用超高效液相色譜法的藥片平均分析時(shí)間與徹底分離率明顯高于高效液相色譜法P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)了超高效液相色譜法在分離速度和徹底分離率方面的優(yōu)越性。

綜上所述，超高效液相色譜法是一種較為常用、應(yīng)用廣泛的藥物檢驗(yàn)分析方法，與常規(guī)藥物檢驗(yàn)分析方法相比較，超高效液相色譜法在靈敏度、速度等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，而且能夠適應(yīng)更好復(fù)雜的環(huán)境，在高壓、高速環(huán)境下，也能進(jìn)行有效的藥物檢驗(yàn)分析。超高效液相色譜法能夠更好適應(yīng)藥物檢驗(yàn)分析測(cè)量高效率的要求，適用于現(xiàn)代藥物檢驗(yàn)分析。