腦缺血損傷后神經(jīng)元發(fā)出“help-me”信號的研究進展

段云霞 吳迪 何小奪 丁玉川

預(yù)適應(yīng)和耐受現(xiàn)象是經(jīng)典的生物自我保護方式，即非致死性損傷能夠顯著降低隨后致死性損傷的程度[1]。近期研究報道，非致死性損傷(局部腦缺血)可以引起神經(jīng)元內(nèi)多重反應(yīng)，向星形膠質(zhì)細胞釋放求救的“help-me”信號，此后周圍的星形膠質(zhì)細胞將自身的線粒體轉(zhuǎn)移給受損神經(jīng)元，維持神經(jīng)元存活[2]。進一步研究提示，神經(jīng)元受損之后可以向神經(jīng)血管單元發(fā)出“help-me”信號，通過促進神經(jīng)干細胞增殖、小膠質(zhì)細胞極化表型轉(zhuǎn)變、內(nèi)皮細胞增生等方式，保護受損神經(jīng)元，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]。超過急性缺血性卒中的治療時間窗，缺血區(qū)神經(jīng)元將出現(xiàn)不可逆性損傷。隨著缺血、缺氧時間的延長、程度的加重，“help-me”信號將降低或消失[4]。不同模型、不同刺激因子下，神經(jīng)元損傷后的“help-me”信號不同。如果能夠找到內(nèi)源性“help-me”信號并作為干預(yù)新靶點，將為卒中后神經(jīng)保護提供更多新思路和方法。筆者就神經(jīng)元損傷后，特別是腦缺血損傷后，內(nèi)源性“help-me”信號的最新研究綜述如下。

1 細胞因子類“help-me”信號

1.1 白細胞介素4(IL-4)

最初的研究結(jié)果表明，IL-4基因敲除動物在局部腦缺血后，梗死體積顯著增加，神經(jīng)功能缺損嚴重，而給予外源性IL-4可以顯著降低梗死體積[(33.4±3.3)%比(50.6±1.9)%，P<0.01]，神經(jīng)功能明顯改善[Longa評分：(1.78±0.22)分比(2.80±0.20)分，P<0.05][5]。進一步研究顯示，短暫缺血后半暗帶區(qū)的神經(jīng)元產(chǎn)生IL-4，促進小膠質(zhì)細胞從M1表型(促進炎性反應(yīng))轉(zhuǎn)變成M2表型(抑制炎性反應(yīng))，降低神經(jīng)元的凋亡，最終實現(xiàn)神經(jīng)保護作用[4,6]。另一項研究結(jié)果同樣表明，IL-4基因敲除小鼠，在局部腦缺血后神經(jīng)功能缺損加重，而局部給予IL-4可以促進小鼠局部腦缺血模型的長期神經(jīng)功能恢復(fù)，IL-4調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞向M2表型轉(zhuǎn)變是重要原因[7]。神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞進行氧糖剝奪后發(fā)現(xiàn)，僅神經(jīng)元培養(yǎng)基中IL-4水平顯著升高，進一步提示IL-4來自于受損的神經(jīng)元[4]。因此，在體和離體實驗均證實，神經(jīng)元受損后可以分泌IL-4，通過調(diào)節(jié)局部微環(huán)境，促進神經(jīng)元存活，顯示IL-4是一種“help-me”信號。IL-4通過調(diào)節(jié)其他細胞因子表達[6]、抑制炎性反應(yīng)[6]、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞表型[7]、調(diào)節(jié)血管新生[7]，在局部腦缺血后發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

1.2 IL-34

IL-34是一種主要由神經(jīng)元生成的細胞因子。研究結(jié)果顯示，IL-34可以促進小膠質(zhì)細胞的發(fā)育和存活，IL-34敲除后僅影響小膠質(zhì)細胞，而不會影響單核巨噬細胞、樹突狀細胞等[8]。Wang等[9]研究結(jié)果顯示，IL-34敲除小鼠的小膠質(zhì)細胞功能顯著降低，進而造成中樞神經(jīng)元抵抗病毒的能力顯著降低。神經(jīng)元受損后可以分泌IL-34，然后激活小膠質(zhì)細胞增殖，增強其吞噬β-淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)，提示IL-34也是一種重要的“help-me”信號[10]。體外研究進一步發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)體系中，加入IL-34可以降低Aβ的神經(jīng)毒性。在體研究結(jié)果表明，給予阿爾茲海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型IL-34后，Aβ濃度顯著降低(與對照組比較，IL-34治療組的Aβ沉淀降為80%，P<0.05)，認知水平明顯改善(小鼠面對恐懼誘導情境做出預(yù)反應(yīng)的比率自40%上升至70%，P<0.05)[10]。但是，IL-34在局部腦缺血后的表達及功能筆者尚未見報道。

1.3 趨化因子配體(C-C motif chemokine ligand 2,CCL2)/CCL2受體(CCL2 receptor,CCR2)

CCL2是家族中的單核趨化蛋白與CCR2結(jié)合傳導信號，是單核細胞、記憶T細胞和自然殺傷細胞的有效化學誘導物。CCL2和CCR2在大腦中的表達部位相似，在皮質(zhì)、紋狀體和蒼白球等神經(jīng)元中均有表達，在星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞中具有不同程度的表達。CCL2具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)遞質(zhì)分泌的作用[11]，CCR2則參與免疫信號的傳導。

在缺血性卒中患者和動物模型中均可檢測到CCL2表達的增加[12-13]。與野生型小鼠相比，CCL2缺陷小鼠的局灶性腦缺血導致梗死面積減小，神經(jīng)功能改善，白細胞浸潤受限，炎性反應(yīng)減輕[13-14]，CCL2缺陷型動物的中性粒細胞和大噬菌體浸潤減少。Dimitrijevic等[15]敲除CCR2后發(fā)現(xiàn)，小鼠局部缺血-再灌注損傷減輕，腦部的細胞因子、中性粒細胞和單核細胞水平減少。但體外研究結(jié)果表明，CCL2對氧糖剝奪和谷氨酸興奮性毒性誘導的神經(jīng)元損傷具有保護作用，通過阻斷細胞內(nèi)鈣的積累，抑制繼發(fā)性谷氨酸外排，并改善隨后的三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)丟失[16]。對與星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)的神經(jīng)元，CCL2通過抑制細胞外谷氨酸和N-甲基-D天冬氨酸受體1表達增加而對N-甲基-D天冬氨酸或Tat神經(jīng)毒性具有保護作用[17]。CCL為血管形成的關(guān)鍵因子，可直接作為血管生成因子參與血管形成，并且已在多項體內(nèi)和體外研究中得到證實[18-19]。CCL2增加膜型1-基質(zhì)金屬蛋白酶的表達、聚集和活性，并促進人內(nèi)皮細胞中血管形成[20]，抑制膜型1-基質(zhì)金屬蛋白酶的表達則抵消了CCL2促血管形成的作用。

1.4 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)

VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細胞生長因子，是機體血管發(fā)育、動態(tài)平衡和病理變化中重要的營養(yǎng)因子之一。在VEGF的多個亞型中，VEGF-A(通常稱VEGF)及其受體VEGF-2是最活躍的因子。

卒中發(fā)生幾小時后，VEGF在缺血半暗帶的表達迅速上升，在24 h達到峰值，之后維持在較低的升高水平。從細胞分布看，卒中數(shù)小時內(nèi)VEGF大量表達于神經(jīng)元，24～48 h后，在星形膠質(zhì)細胞檢測到VEGF表達。VEGF的受體在卒中發(fā)生后，與VEGF發(fā)生著相似的變化。VEGF可以通過增加內(nèi)皮細胞的增殖和遷移來促進恢復(fù)血管生成，減少損傷后延遲階段的神經(jīng)缺陷。在局部缺血48 h后，側(cè)腦室注射VEGF165，可顯著改善半暗帶的微血管灌注和血管生成，促進神經(jīng)功能恢復(fù)[21]，并且呈劑量依賴性地增加微血管密度[22]。體外研究證實，VEGF可減輕興奮毒性和氧糖剝奪誘導的神經(jīng)元損傷[23-25]。此外，體外研究表明，VEGF可以有效促進神經(jīng)元新生；體內(nèi)研究證實，VEGF可促進內(nèi)皮細胞和膠質(zhì)細胞新生[3]。在小鼠腦缺血模型中，過度表達VEGF，神經(jīng)發(fā)生在腦室室管膜下區(qū)顯著增加，成神經(jīng)細胞向半暗帶擴散，并且在腦缺血后7～28 d持續(xù)有新生神經(jīng)元出現(xiàn)[25]。

其他細胞因子類“help-me”信號還包括趨化因子CX3C蛋白、IL-10等。上述細胞因子類“help-me”信號主要通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞表型的變化，降低神經(jīng)元損傷，維持血管神經(jīng)單元完整性，最終達到神經(jīng)保護的作用[26]。

2 脂蛋白類“help-me”信號

載脂蛋白2(lipocalin-2，LCN2)屬于脂質(zhì)運載蛋白超家族的一個小分泌蛋白，與相應(yīng)膜受體結(jié)合后可捕獲鐵離子轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)。LCN2在多個臟器缺血-再灌注損傷后，在梗死區(qū)和周圍組織中表達均增加[27]。越來越多的臨床研究結(jié)果表明，LCN2在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病[28]、多發(fā)性硬化[29]、腦缺血[30-31]等疾病中，均顯著增加。

動物模型研究結(jié)果表明，LCN2誘導了損傷神經(jīng)元中的氧化應(yīng)激[32-34]。Xing等[35]研究結(jié)果顯示，LCN2是由缺血性神經(jīng)元分泌，并不是膠質(zhì)細胞。而且，在體外細胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，在氧糖剝奪后神經(jīng)元條件培養(yǎng)基中LCN2釋放增加，但在小膠質(zhì)細胞或星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中未檢測到。因此，LCN2可能作為局部腦缺血后受損神經(jīng)元發(fā)出的“help-me”信號，激活受損細胞周圍的小膠質(zhì)細胞活化，增加IL-10的分泌，增強其吞噬能力，并上調(diào)突觸泡蛋白和突觸后蛋白95；激活星形膠質(zhì)細胞，增加多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，抵抗氧糖剝奪誘導的神經(jīng)元損傷。但是，Jin等[36]的一項研究結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細胞表達LCN2和LCN2缺陷減輕了小鼠瞬態(tài)模型的神經(jīng)炎性反應(yīng)和血-腦屏障滲透，降低腦缺血-再灌注損傷，與Xing等[35]研究結(jié)果不一致，可能與動物種屬和使用模型有關(guān)，因為小鼠基因不同于大鼠和人類同源物[37]。因此，精確理解LCN2在“help-me”信號傳導中介導損傷和修復(fù)之間的平衡，對于尋找卒中恢復(fù)治療方法非常有幫助。

3 線粒體“help-me”信號

線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器之一，線粒體內(nèi)的電子傳遞鏈消耗氧氣并產(chǎn)生ATP，是機體的能量核心，因此線粒體在生理和病理狀態(tài)下對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。線粒體功能障礙是缺血性卒中早期的病理特征之一，可產(chǎn)生大量氧自由基并迅速耗竭ATP[38]。作為人體中最耗能的器官之一，中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度依賴線粒體以維持體內(nèi)平衡。對神經(jīng)元而言，線粒體不僅為氧化代謝和ATP生成提供了基礎(chǔ)，而且還通過抗氧化酶和凋亡介質(zhì)積極調(diào)節(jié)生存與凋亡之間的信號平衡。線粒體成為“help-me”信號，進一步提供了神經(jīng)元損傷后自我保護的證據(jù)。

Hayakawa等[2]研究結(jié)果表明，在小鼠腦缺血后，星形膠質(zhì)細胞可以向受損神經(jīng)元傳遞功能性線粒體，幫助神經(jīng)元抵抗損傷和完成修復(fù)，在神經(jīng)細胞氧糖剝奪實驗中進一步確認，鈣依賴性CD38信號傳導上調(diào)，星形膠質(zhì)細胞向受損神經(jīng)元提供線粒體支持的關(guān)鍵分子。蛛網(wǎng)膜下腔出血可以導致患者和大鼠腦脊液中線粒體膜電位降低，而腦脊液中較高的膜電位與蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的良好預(yù)后相關(guān)[39-40]。體外研究結(jié)果表明，氧糖剝奪誘導的線粒體融合可導致神經(jīng)元死亡，而抑制線粒體裂變可減輕小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，并降低小鼠腦梗死體積[41]。Babenko等[42]發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)元，可以觀察到線粒體由間充質(zhì)干細胞逆向轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元，對腦缺血大鼠靜脈注射間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)元共培養(yǎng)體系，可以有效減輕大鼠的腦梗死體積。以上研究結(jié)果表明，神經(jīng)元損傷后發(fā)出“help-me”信號，星形膠質(zhì)細胞等將線粒體轉(zhuǎn)移至相鄰的神經(jīng)元中，幫助受損神經(jīng)元度過缺血急性期，“help-me”信號(線粒體膜電位)高低可能與患者預(yù)后密切相關(guān)，提示以線粒體為靶點的“help-me”信號，可能為缺血性卒中治療提供新的研究方向。

4 “help-me”信號的應(yīng)用前景

確定“help-me”信號，明確了神經(jīng)元損傷后的動態(tài)變化過程，在損傷早期，神經(jīng)元通過各種求助方式確保最低的存活要求；損傷超出神經(jīng)元能夠承受限度后，“help-me”信號可能已經(jīng)消失或成為不具有作用的靶點。因此，“help-me”信號可能是早期神經(jīng)元損傷后逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元死亡或凋亡的關(guān)鍵分子。其次，缺血性卒中患者的“help-me”信號應(yīng)源自半暗帶組織，此時局部腦組織損傷，“help-me”信號可能通過受損的血-腦屏障，在血液中表達升高。最后，針對取栓后神經(jīng)功能并未完全保護的現(xiàn)狀，盡管最新指南將缺血性卒中的治療時間窗延長至24 h[43]，但靜脈溶栓或機械取栓治療均仍有嚴格的限制條件，其中影像學評估的半暗帶組織是超出初始時間窗(6 h)取栓治療的重要依據(jù)[1]。有研究結(jié)果表明，即使采用目前國內(nèi)外指南所推薦的最佳治療方案，大動脈閉塞所致的急性缺血性卒中患者中，經(jīng)血管再通治療后仍有近40%患者預(yù)后不良(90 d 改良Rankin量表評分≥ 3分)[2]。因此，在取栓廣泛開展的時代，在有效再灌注基礎(chǔ)上的腦保護治療可能降低神經(jīng)系統(tǒng)損傷，顯著改善患者預(yù)后[3]。有效的再通和神經(jīng)保護是上述研究中保證受損神經(jīng)元存活并產(chǎn)生“help-me”信號的基本條件。最早于Nature Medicine提出的“新的缺血半暗帶”概念指出，新的半暗帶是受損后可能促進腦組織修復(fù)的腦組織[44]。因此，我們推測，急性缺血性卒中后，有效血管再通基礎(chǔ)上聯(lián)合神經(jīng)保護治療，可能保護新的半暗帶組織，增加受損神經(jīng)元更多釋放“help-me”信號，最終達到增強神經(jīng)保護作用的目標。