ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在石榴中的應(yīng)用

張 慧，朱 薇*，韓 騰，王慶軍

（1棗莊市特色果品工程推廣站，山東棗莊 277000；2棗莊市石榴研究中心）

石榴（Punica granatum L.）屬被子植物門，雙子葉植物綱，原始花亞綱，為千屈菜科（Lythraceae）石榴屬（Punica L.）落葉灌木或小喬木。石榴在中文版《中國植物志》中歸屬于石榴科石榴屬植物，而新版《Flora of China》將石榴屬歸并到千屈菜科[1]。石榴又稱安石榴、涂林、丹若、海榴等，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等地，向東傳播到東亞等國，向西傳播到地中海地區(qū)及美洲各適生地[2,3]。在長期栽培中，因基因突變、天然雜交、人工選擇形成了豐富的種質(zhì)資源，在全世界范圍內(nèi)有1000多個(gè)石榴品種及野生型品種[4]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是石榴分子資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究的有力工具，能夠直接從DNA分子水平上反映各材料間的遺傳差別。本文系統(tǒng)地介紹了國內(nèi)外ISSR分子標(biāo)記在石榴分子資源遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展，以期為石榴種質(zhì)資源的收集、保存、遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定等研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 I SSR分子標(biāo)記

ISSR（簡單重復(fù)序列）分子標(biāo)記技術(shù)，是由Zietkiewicz等[5]，在1994年以DNA重復(fù)序列為重點(diǎn)，基于一種SSR微衛(wèi)星基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記技術(shù)，被人工合成的16～18個(gè)SSR序列，在其3′端或5′端加錨1～4個(gè)嘧啶堿基或嘌呤，使用引物對反向排列SSR的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并對其電泳、染色，通過譜帶的相對位置和有無，來研究不同試材間的多態(tài)性，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)采用重復(fù)序列技術(shù)組合和PCR技術(shù)建立起來的一種廣泛用于于石榴中微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)[6]。ISSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)如下∶ISSR分子標(biāo)記技術(shù)克服了RAPD、AFLP、RFLP和SSR的技術(shù)性缺點(diǎn)，具有經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、易操作、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性高、無需測序和克隆等優(yōu)勢。

2 I SSR分子標(biāo)記技術(shù)在石榴中的應(yīng)用

2.1 石榴遺傳多樣性的研究

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，一個(gè)物種的遺傳多樣性越豐富，適應(yīng)環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)[7]。

王慶軍等[8]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對山東和美國等地的35個(gè)觀賞石榴品種的遺傳關(guān)系及分類分析。通過篩選出8條多態(tài)性高的ISSR引物對35個(gè)觀賞石榴品種進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出168個(gè)基因位點(diǎn)，其中158個(gè)為多態(tài)性基因位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比高達(dá)94.05%。平均有效等位基因數(shù)1.6785、平均觀察等位基因數(shù)1.9405、平均Shannon信息指數(shù)0.5530、平均Nei's基因多樣性指數(shù)0.3799。35個(gè)觀賞石榴品種間遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.4167～0.9226，說明其品種間具有豐富的遺傳多樣性。馬麗等[9]以65個(gè)果用石榴品種為材料，采用ISSR分子標(biāo)記研究了果用石榴類群品種的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。結(jié)果表明∶通過篩選出10條多態(tài)性高的ISSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出186個(gè)DNA位點(diǎn)，其中161個(gè)為多態(tài)性DNA位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)比高達(dá)86.56%，等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei′s基因多樣性指數(shù)、Shannon 信息指數(shù)分別為∶1.8656、1.3119、0.2092、0.3389。65個(gè)果用石榴品種間遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.478～0.995，說明其品種間具有豐富的遺傳多樣性。Narzary等[10]通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對49個(gè)印度野生石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，通過篩選出17條多態(tài)性高的ISSR引物對49個(gè)印度野生石榴品種進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出308個(gè)基因位點(diǎn)，其中268個(gè)為多態(tài)性基因位點(diǎn)，多態(tài)性率高達(dá)87.01%，多態(tài)性介于71.43～100.00之間，平均觀察等位基因數(shù)1.3375、平均有效等位基因數(shù)1.2250、平均Nei's基因多樣性指數(shù)0.1250、平均Shannon信息指數(shù)0.1888，遺傳距離分布范圍為0.05～0.45，平均是0.25，表明野生石榴遺傳多樣性較高。趙麗華[11]采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析中國石榴居群遺傳結(jié)構(gòu)的ISSR。結(jié)果表明∶7個(gè)石榴種群遺傳多樣性從小到大依次為∶新疆種群、四川種群、安徽種群、河南種群、云南種群、陜西種群、山東種群；7個(gè)石榴種群間的基因分化系數(shù)是0.1911，表明種群間的遺傳變異占總遺傳變異比率為19.11%，種群內(nèi)的遺傳變異占總遺傳變異比率高達(dá)81.89%，種群間表現(xiàn)較低遺傳分化；7個(gè)石榴群間基因流的估測值是2.1169，遺傳相似性分布范圍為0.9218～0.9759，表明石榴種群間具有很高的遺傳相似性及強(qiáng)大的基因流，因此石榴品種間的遺傳多樣性才能夠得以維持。王慶軍等[12]還篩選8條ISSR引物對24個(gè)山東石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。擴(kuò)增出178個(gè)基因位點(diǎn)，平均每條引物擴(kuò)增出22.25個(gè)基因位點(diǎn)，其中多態(tài)性基因位點(diǎn)122個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)比率是68.54%。平均有效等位基因數(shù)1.3790、平均觀察等位基因數(shù)1.6854、平均Shannon信息指數(shù)0.3453、Nei’s基因多樣性指數(shù) 0.2282；24 個(gè)山東石榴品種的遺傳相似系數(shù)介于0.6742～0.9101，說明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可有效用于山東石榴品種的遺傳多樣性分析。

2.2 石榴親緣關(guān)系與分類學(xué)研究

石榴在長期栽培和傳播過程中，因基因突變、天然雜交、人工選擇形成了豐富的種質(zhì)資源，所以具有比較復(fù)雜的遺傳背景，傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記等在對石榴進(jìn)行分類研究時(shí)，均存在一定的缺陷，不具備很強(qiáng)的說服力，而從DNA層面進(jìn)行研究的ISSR標(biāo)記技術(shù)可以很好地解決這一問題。

Ghobadi等[13]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選出6條引物對24個(gè)伊朗石榴品種進(jìn)行親緣關(guān)系分析，多態(tài)性條帶是64條，在65%相似性水平下，24個(gè)伊朗石榴品種被分為5個(gè)類群，分析結(jié)果表明，ISSR分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不完全一致。沈進(jìn)[14]采用ISSR技術(shù)篩選出17條引物對中國45份石榴種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析，擴(kuò)增出條帶數(shù)有187，其中多態(tài)性條帶有157條，平均每個(gè)引物11條，多態(tài)性比率高達(dá)83.96%。利用聚類分析，以遺傳距離閥值為19時(shí)，45份石榴種質(zhì)被聚為4類，結(jié)果表明ISSR分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果不一致，同時(shí)也贊同了Ghobadi等的結(jié)論。趙麗華等[15]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對47個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，47個(gè)石榴品種通過篩選出6條引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出120條基因條帶，其中多態(tài)性條帶有109條，多態(tài)性比率高達(dá)90.83%，平均Nei’s基因多樣度0.1897、平均有效等位基因數(shù)1.2945、平均Shannon信息指數(shù)0.3091、遺傳距離為 0.0750～0.4000，表明 47個(gè)石榴品種間具有比較豐富的遺傳多樣性,利用UPGMA法構(gòu)建分子樹狀圖，以遺傳相似性系數(shù)0.7767為閾值，將47個(gè)石榴品種分為5個(gè)類群，分類結(jié)果與地理和形態(tài)分布無關(guān)。Ajal等[16]篩選出8條引物，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對摩洛哥27個(gè)石榴品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，擴(kuò)增出70條條帶，其中61條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性率高達(dá)87.14%，多態(tài)性范圍42.86～100.00，遺傳距離介于0.12～1.00，平均為0.67，總基因多樣性參數(shù)為0.35及群體內(nèi)基因多樣性參數(shù)為0.32，且種群間基因流較大為5.8，ISSR聚類結(jié)果表明與品種的地理來源無關(guān)，同時(shí)也贊同了趙麗華等[15]的結(jié)論。

3 問題與展望

隨著對石榴種質(zhì)資源重要性的認(rèn)識不斷加強(qiáng),石榴種質(zhì)資源的收集、保存、合理評價(jià)及有效利用等問題越來越受到石榴種質(zhì)資源相關(guān)部門和工作者的重視。分子生物學(xué)尤其是分子標(biāo)記的發(fā)展為石榴資源提供了更為清晰的遺傳背景,ISSR分子標(biāo)記作為一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，在石榴分子資源遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系與分類學(xué)研究等方面已取得了較大進(jìn)展與廣泛的應(yīng)用。但與其它果樹相比，ISSR應(yīng)用于石榴研究起步晚，基礎(chǔ)差，仍然存在不足，比如ISSR大部分為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合體與雜合體，因此在進(jìn)行兩倍體或多倍體物種的種群多樣性研究時(shí)，目前還未找到一種合適的數(shù)學(xué)模型來對其數(shù)據(jù)分析[17]。當(dāng)今，由于石榴集經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)、生態(tài)、觀賞等價(jià)值于一體，所以越來越受到消費(fèi)市場的青睞，國內(nèi)外石榴產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展[18]。相信隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)憑借其經(jīng)濟(jì)、簡便、快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、節(jié)省時(shí)間、財(cái)力和物力等優(yōu)點(diǎn)必將使其在石榴領(lǐng)域越來越得到廣泛應(yīng)用，特別是應(yīng)用于大批量材料的研究，對石榴種質(zhì)資源研究發(fā)揮更大的作用。