標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)綜述

楊麗霞

天津市靜海區(qū)醫(yī)院免疫科 （天津 301600）

標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)是指對已經(jīng)確定好的抗原或抗體通 過物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并通過測定標(biāo)記物質(zhì)的含量獲得抗原-抗體的反應(yīng)結(jié)果，進(jìn)而準(zhǔn)確求出檢測抗原-抗體具體含量的一種技術(shù)，可以滿足臨床定性與定量分析的要求。標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)整個操作流程較為簡單快捷，已被廣泛應(yīng)用于免疫檢驗工作中[1]?，F(xiàn)階段，臨床所使用的標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)主要包括酶標(biāo)記技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)等[2-3]。現(xiàn)將各種標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)的發(fā)展、特點及應(yīng)用綜述如下。

1 酶標(biāo)記技術(shù)

酶標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用要追溯到1971年的酶聯(lián)免疫吸附試驗，通過此項試驗，抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化作用被有效地結(jié)合起來，而且制備所得的酶標(biāo)記物穩(wěn)定性更好、保存時間更長[4]。按反應(yīng)后的酶標(biāo)記物是否分離結(jié)合和游離，可以將酶標(biāo)記技術(shù)分為均相酶標(biāo)記技術(shù)和異相酶標(biāo)記技術(shù)兩種。

均相酶標(biāo)記技術(shù)是利用酶作為標(biāo)記物，在均勻的液相中進(jìn)行的免疫檢驗技術(shù)，該技術(shù)在應(yīng)用過程中無需分離抗原抗體復(fù)合物，操作較為簡單。酶擴(kuò)大免疫檢驗技術(shù)及克隆酶供體免疫檢驗技術(shù)屬臨床上應(yīng)用較為廣泛的兩種均相酶標(biāo)記技術(shù)。酶擴(kuò)大免疫檢驗技術(shù)以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶作為標(biāo)記酶，標(biāo)記酶可以將底物輔酶轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型輔酶，進(jìn)而通過分光光度法進(jìn)行測定。在克隆酶供體免疫檢驗技術(shù)中，游離的酶供體標(biāo)記抗原可以與酶受體結(jié)合，結(jié)合后可以形成帶有活性的全酶，且全酶活性與樣品中的待測蛋白含量呈一定的比例關(guān)系，根據(jù)這種比例關(guān)系可以間接計算目標(biāo)蛋白含量[5-6]。克隆酶供體免疫檢驗技術(shù)可用于血漿環(huán)孢菌素A 濃度的監(jiān)測，具有操作簡便、標(biāo)本無需煩瑣的前處理、精密度好、線性范圍寬等優(yōu)點，更便于臨床實驗室應(yīng)用[6]。此外，均相酶標(biāo)記技術(shù)在小分子抗原和半抗原的測定中應(yīng)用較為廣泛，如臨床通過應(yīng)用均相酶標(biāo)記技術(shù)檢測尿液中香草苦杏仁酸的含量來診斷嗜鉻細(xì)胞瘤，同時，該技術(shù)還被用于霉酚酸血藥濃度的測定中[7-8]。

異相酶標(biāo)記技術(shù)是對分離的酶標(biāo)記物和游離的酶標(biāo)記物進(jìn)行測定的一種技術(shù)，其特點在于標(biāo)記的酶本身活性不會發(fā)生改變，相比于均相酶標(biāo)記技術(shù)，異相酶標(biāo)記技術(shù)的臨床應(yīng)用更加廣泛。目前，酶聯(lián)免疫吸附檢驗技術(shù)是臨床上應(yīng)用最為廣泛的異相酶標(biāo)記技術(shù)之一，主要用于傳染?。ㄈ缃Y(jié)核）和惡性腫瘤疾?。ㄈ绶伟┑脑\斷、血藥濃度檢測及食品安全評估等領(lǐng)域[9]。酶聯(lián)免疫吸附檢驗技術(shù)所采用的微孔板具有良好的吸附性，各個孔之間的差異較小。帶有琥珀酰亞胺酯活化的微孔板具有反應(yīng)充分、使用方便快捷的優(yōu)點。目前，日本所推出的AIA-1800和G7免疫分析系統(tǒng)具有較高的靈敏度，實際檢測時間較短，線性范圍較寬[10]。此外，近年來，臨床所應(yīng)用的放大系統(tǒng)使酶標(biāo)記技術(shù)的靈敏度也得到了大幅提升，如底物循環(huán)、生物素-親和素/鏈霉親和素系統(tǒng)、酶-抗酶復(fù)合物系統(tǒng)、催化受體沉積技術(shù)、微顆粒放大技術(shù)等，尤其是催化受體沉積技術(shù)，可以避免酶和抗體的直接連接，體系的靈敏度可以被放大2個數(shù)量級[11-12]。在此基礎(chǔ)上，異相酶標(biāo)記技術(shù)逐漸開始與其他技術(shù)結(jié)合，如聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)、聯(lián)合固相膜滲濾技術(shù)的斑點-酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)，這些聯(lián)合應(yīng)用的標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)避免了標(biāo)記反應(yīng)過程中酶活性的降低，且整個操作流程簡單快捷，促進(jìn)了酶免疫檢驗技術(shù)在深度與廣度方面的發(fā)展，從而能夠更好地為臨床提供服務(wù)[13-15]。

2 熒光標(biāo)記技術(shù)

20世紀(jì)90年代，熒光標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)在整個標(biāo)記免疫檢測方法學(xué)中占據(jù)著十分重要的地位，且發(fā)展十分迅速，同時其仍是目前標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)中最有發(fā)展前途的技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于食品安全、血漿特定蛋白測定及血清腫瘤標(biāo)志物的檢測[16-17]。傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)常用有機(jī)熒光染料如四乙基羅丹明、異硫氰基熒光素等作為標(biāo)記物，該測定方法極易受到散射光和背景熒光等因素的影響，分析靈敏度較低，臨床應(yīng)用范圍受到一定的限制[18]。時間分辨熒光免疫檢驗技術(shù)所使用的標(biāo)記物不再是有機(jī)熒光染料，而是鋱、銪等標(biāo)記抗體或抗原，銪可以在紫外光作用下產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光且衰變時間較長（通?？蛇_(dá)60～900 μs），該技術(shù)的特異度、靈敏度均較高，靈敏度甚至可達(dá)10-19mol/L 的水平[19-20]。熒光納米微粒為一種應(yīng)用于熒光標(biāo)記的新型生物分子標(biāo)記物，通過改變微粒直徑可以獲得不同顏色的材料，包被熒光微粒的微球可以作為固相反應(yīng)載體和熒光親和試劑，在信號檢測中發(fā)揮十分重要的作用，該技術(shù)的靈敏度較高，其優(yōu)勢在于可以有效標(biāo)記免疫球蛋白和轉(zhuǎn)移蛋白，臨床上可以用于C 反應(yīng)蛋白檢測[21-22]。近年來，多重?zé)晒鈽?biāo)記技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于臨床，該技術(shù)可以同時測定多個待測樣本，大大提高了檢測效率。此外，基于熒光標(biāo)記技術(shù)所研發(fā)的試劑盒也逐漸被應(yīng)用于臨床，如DNA 核酸類、多肽和蛋白類熒光標(biāo)記試劑盒等，上述試劑盒大多具有較高的檢測靈敏度和特異度，市場應(yīng)用前景良好。

3 膠體金標(biāo)記技術(shù)

膠體金標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，固相載體則可以選用硝酸纖維素膜，繼而形成紅色免疫反應(yīng)物質(zhì)，并可被肉眼直接觀察，因此，該技術(shù)可用于定性或半定量的快速免疫檢測，臨床應(yīng)用更加方便，已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷與床邊檢測[23-26]。此外，膠體金標(biāo)記的免疫反應(yīng)簡便快捷，其相關(guān)的試劑盒價格也較為低廉，可以更好地應(yīng)用于傳染病、藥物濫用、腫瘤標(biāo)志物、寄生蟲及中藥材活性成分等的檢測[27]。

4 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)

化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)是指在待檢測的分子上連接可激活發(fā)光的化合物的方法。直接化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)所測定的標(biāo)記物質(zhì)以吖啶酯類為主，其特點為不易受到外界因素的干擾，標(biāo)記過程亦相對較為簡單，臨床上主要用于膽紅素、維生素D 等的檢測[28-29]。酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)使用酶標(biāo)記抗體或抗原后可以形成酶標(biāo)記的抗原-抗體復(fù)合物質(zhì)，可以催化化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光，臨床上大多用于甲狀腺激素的檢測，用以評估甲狀腺功能[30-31]。電化學(xué)發(fā)光通過應(yīng)用電促發(fā)光技術(shù)可以確保能量傳遞參與到化學(xué)反應(yīng)中，如通過應(yīng)用N-羥基琉酰胺酯標(biāo)記抗體或抗原，可以使三丙胺參與到化學(xué)反應(yīng)中，從而能夠準(zhǔn)確反映樣品中抗原或抗體的含量，臨床上大多用于乙肝表面抗原的檢測，用于評價乙肝的感染情況[32-34]。

5 小結(jié)

近年來，隨著臨床免疫檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，除了已得到廣泛應(yīng)用的酶標(biāo)記技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)外，以免疫濁度測定自動化和標(biāo)記免疫測定自動化為主的標(biāo)記自動化技術(shù)因應(yīng)用更加方便、快捷而越來越被臨床重視。業(yè)界后續(xù)仍需進(jìn)一步加大對標(biāo)記免疫檢驗技術(shù)的研究力度，以更好地服務(wù)于臨床檢驗工作。