安賽蜜對(duì)大鼠的亞慢性毒性

鄭思雨 滕晶晶 楊同金 王 巖 夏 新 鮑軍輝

(安徽省疾病預(yù)防控制中心, 安徽 合肥 230601)

安賽蜜甜味純正而強(qiáng)烈,為蔗糖的200倍,對(duì)光、熱穩(wěn)定,pH適用范圍較廣(pH為3～7)[1]。作為第4代合成甜味劑,安賽蜜在體內(nèi)不代謝、不蓄積,可以單獨(dú)使用,也可以與其他甜味劑混合使用并產(chǎn)生很強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng),被認(rèn)為是最有前途的甜味劑之一[2]。目前,普遍使用雙乙烯酮和氨基磺酸合成安賽蜜,其原料來源廣、生產(chǎn)成本低,適用于連續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)[3-4]。GB 2760—2014中規(guī)定了安賽蜜作為甜味劑允許使用的類別和最大使用量[5]。而食品中超范圍、超限量使用甜味劑,濫用復(fù)合甜味劑等問題比較突出,已成為高度重視的社會(huì)問題[6]。

近年來,人們對(duì)食品添加劑的應(yīng)用越來越重視,對(duì)安賽蜜在各食品中含量檢測及其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究也越來越多[7-10]。歐洲食品安全局(EFSA)及糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFA)對(duì)安賽蜜作為食品添加劑的安全性已經(jīng)過嚴(yán)格的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,但中國對(duì)安賽蜜食用的安全性較少有報(bào)道,對(duì)其連續(xù)的、長期的食用安全性及相關(guān)毒理學(xué)評(píng)價(jià)也缺乏相應(yīng)研究。隨著安賽蜜生產(chǎn)工藝的不同及技術(shù)革新,安賽蜜的安全性及其與其他甜味劑的協(xié)同使用在長期食用下是否會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生影響仍值得深究[11-12]。

研究擬依據(jù)GB 15193.13—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 90天經(jīng)口毒性試驗(yàn)》,旨在通過大鼠的90 d經(jīng)口毒性試驗(yàn)探討安賽蜜作為食品添加劑的安全性以及得出未觀察到有害作用劑量(NOAEL)值,以期為正確認(rèn)識(shí)安賽蜜及食品添加劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

健康離乳SD大鼠:4周齡,80只(雌雄各半),清潔級(jí),動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)20200812AaZZ0619000686(雌性)、20200812AaZZ0619000206(雄性),試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(皖)2019-011,生產(chǎn)許可證號(hào)為蘇飼證(2019)01008,浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;

安賽蜜:≥99%,安徽維多食品配料有限公司;

生化分析儀試劑:美國貝克曼庫爾特有限公司;

血常規(guī)分析試劑:日本Sysmex(希森美康)株式會(huì)社;

血凝儀試劑:南京瑞麥科技開發(fā)有限公司;

尿液分析試劑:桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司;

全自動(dòng)生化分析儀:AU480型,美國貝克曼庫爾特有限公司;

五分類血液分析儀:2000i型,日本Sysmex公司;

半自動(dòng)血凝儀:AYW8001型,南京瑞麥科技開發(fā)有限公司;

尿液分析儀:330型,桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司;

多功能酶標(biāo)儀:Spectramax M2e型,美國MD公司;

全封閉式組織脫水機(jī):ASP200S型,德國Leica公司;

包埋機(jī):BMJ-3型,中威電子儀器有限公司;

石蠟病理切片機(jī):RM2126KT型,德國Leica公司;

顯微鏡:Eclips Ci型,日本Nikon公司;

電子天平:PB403-S/FACT型,瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 80只大鼠按性別、體重隨機(jī)分成4組,每組20只,雌雄各半,單籠飼養(yǎng)于安徽省疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物房屏障環(huán)境中,溫度20～25 ℃、濕度50%～70%。所有動(dòng)物試驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d,試驗(yàn)期間大鼠單籠飼養(yǎng),自由飲水和攝食。

1.2.2 受試物劑量選擇及給予方式 分別設(shè)高、中、低3個(gè)劑量組,根據(jù)WHO聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)推薦的安賽蜜日均最大攝入量為15 mg/kg,以推薦攝入量的300倍,即4 500 mg/kg體重為高劑量組,中、低劑量分別為1 500,500 mg/kg體重(相當(dāng)于人體推薦攝入量的100,33.3倍),另設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照組,共4個(gè)劑量組。采用灌胃方式經(jīng)口染毒,灌胃容量為10 mL/kg體重,每日定時(shí)染毒一次(每周灌胃6 d),持續(xù)90 d。

1.2.3 指標(biāo)測定

(1) 一般觀察:觀察動(dòng)物的一般表現(xiàn)和中毒體征等,試驗(yàn)期間,前4周每周稱體重2次,之后每周稱體重1次,每周稱量一次飼料,計(jì)算飼料消耗和體重增長情況。

(2) 尿液測定:試驗(yàn)結(jié)束時(shí),動(dòng)物禁食16 h后稱重,采集尿液,檢測尿蛋白(PRO)、尿比重(SG)、酸堿度(pH)、葡萄糖(GLU)以及隱血(BLD)。

(3) 血液學(xué)測定:麻醉取血,檢測紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、白細(xì)胞數(shù)(WBC)及其分類計(jì)數(shù)(中性粒、淋巴、單核、嗜酸、嗜堿)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)。

(4) 血液生化測定:采血進(jìn)行生化指標(biāo)檢測,包括肌酐(Cr)、血糖(Glu)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、尿素、氯、鈉及鉀含量。

(5) 臟體比:肉眼觀察大鼠體表、體腔及臟器,稱量腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸、附睪、子宮與卵巢的絕對(duì)重量,計(jì)算臟器系數(shù)。

(6) 組織病理學(xué)檢查:對(duì)腦、甲狀腺、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、胃、十二指腸、結(jié)腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、睪丸及膀胱等臟器做組織病理學(xué)檢查。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 一般臨床觀察、動(dòng)物體重增長量、總攝食量、總食物利用率

由表1可知,試驗(yàn)期間雌性陰性對(duì)照組大鼠及雄性中、高劑量組大鼠各死亡1只,各劑量組其余動(dòng)物染毒期間未見明顯中毒體征和其他方面改變。受試物以高、中、低劑量進(jìn)行大鼠灌胃染毒90 d,各組動(dòng)物體重增長量、總攝食量、總食物利用率與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),認(rèn)為安賽蜜喂養(yǎng)大鼠90 d對(duì)其體重增長、攝食量和食物利用率無影響。

表1 安賽蜜對(duì)大鼠體重增長量、總攝食量、總食物利用率的影響

2.2 血液學(xué)檢測

試驗(yàn)結(jié)束對(duì)各劑量組雌、雄大鼠的血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測,由表2可知,僅雄性大鼠低劑量組血紅蛋白濃度和雌性中劑量組血小板計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05),各劑量組之間也未表現(xiàn)出明顯的劑量—反應(yīng)關(guān)系。其余各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),認(rèn)為安賽蜜對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)無影響。

2.3 血生化指標(biāo)檢測

由表3可知,各劑量組雌、雄大鼠的血清生化指標(biāo)結(jié)果僅雌性動(dòng)物低劑量組總膽固醇與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P<0.05)。這可能是由于安賽蜜只提供甜味不提供能量,只在味覺上得到甜的感知,使得大鼠進(jìn)一步增加飲食獲得飽腹感,進(jìn)而導(dǎo)致總膽固醇含量升高[13]。其余各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比差異均不明顯(P>0.05),各劑量組血生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。

表3 安賽蜜對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響?

2.4 尿液檢測

試驗(yàn)結(jié)束對(duì)大鼠尿液進(jìn)行檢測,由表4可知,各劑量組雌、雄大鼠的尿常規(guī)指標(biāo)與對(duì)照組相比差異均無顯著性差異(P>0.05),各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi),提示安賽蜜對(duì)大鼠尿常規(guī)無明顯影響。

表4 安賽蜜對(duì)大鼠尿常規(guī)指標(biāo)的影響?

2.5 大體解剖及組織學(xué)檢查

2.5.1 大體解剖 由表5可知,所有大鼠大體解剖未發(fā)現(xiàn)心、肝、脾、肺、腎、睪丸、心臟、胸腺和腎上腺等臟器的異常。各劑量組臟器重量與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雌性低、中劑量組肝臟系數(shù)與對(duì)照組具有極顯著差異(P<0.01),雄性中劑量組心臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、高劑量組心臟系數(shù)與對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.05)。有研究[14-15]表明,安賽蜜可增加小鼠肝臟脂肪的生成,誘導(dǎo)脂質(zhì)異常從而加劇動(dòng)脈粥樣硬化,安賽蜜還可能引起小鼠腸道菌群的改變和體重增加。但這并未導(dǎo)致每個(gè)劑量組的指標(biāo)發(fā)生改變,也未在體重增重及臟器重量上有所體現(xiàn),考慮為單一劑量組的偶發(fā)現(xiàn)象。其余各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表5 安賽蜜對(duì)大鼠臟器重量的影響

2.5.2 組織病理學(xué)檢查 由表6可知,試驗(yàn)結(jié)束,對(duì)高劑量組和陰性對(duì)照組所有大鼠的腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、腎、脾、腎上腺、胃、十二指腸、結(jié)腸、胰、腸系膜淋巴結(jié)、卵巢、睪丸和膀胱等做組織病理學(xué)檢查,檢查發(fā)現(xiàn)的主要病理改變見表7。但這些病理改變無特異性,也無劑量—反應(yīng)關(guān)系,考慮為自發(fā)性病變,與受試物無關(guān),未對(duì)其他劑量組進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

表6 安賽蜜對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響?

表7 大鼠臟器病理改變異常結(jié)果

3 結(jié)論

安賽蜜分別以4 500,1 500,500 mg/kg體重(相當(dāng)于人體推薦攝入量的300,100,33.3倍)的劑量經(jīng)口染毒90 d,雌、雄性大鼠的體重增長、攝食量、食物利用率均無明顯異常;各劑量組的血液、血生化、尿常規(guī)指標(biāo)、臟器重量、臟體比等雖出現(xiàn)了部分指標(biāo)的異常改變,但無劑量—反應(yīng)關(guān)系,并且異常指標(biāo)均在參考范圍之內(nèi),多考慮是偶發(fā)因素,無生物學(xué)意義;組織病理學(xué)檢查中部分組織病理改變程度較輕且無組間差異,考慮與試驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量及動(dòng)物自發(fā)性病變有關(guān),與安賽蜜的影響無關(guān);雌性大鼠的肝臟系數(shù)與對(duì)照組比較存在顯著性差異,與文獻(xiàn)[16]結(jié)果基本一致,安賽蜜對(duì)大鼠長期染毒導(dǎo)致體重及肝臟重量的變化,但組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常改變,也未在高劑量組中得以驗(yàn)證,所以多考慮為單一組別的偶發(fā)現(xiàn)象。總體來說,在試驗(yàn)條件下以每天4 500 mg/kg體重劑量(相當(dāng)于人體推薦攝入量的300倍),連續(xù)90 d對(duì)大鼠進(jìn)行安賽蜜灌胃染毒,試驗(yàn)動(dòng)物完全耐受,認(rèn)為在推薦攝入量以內(nèi)食用安賽蜜是安全的,大鼠90 d經(jīng)口未觀察到有害作用劑量值雌雄均為4 500 mg/kg體重。但是,安賽蜜作為一種新興污染物存在于環(huán)境中對(duì)人類是否會(huì)產(chǎn)生影響仍是未來研究的重點(diǎn)探討。