谷物及其制品中真菌毒素的前處理及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

侯廣月，杜營，楊帆，周莉莉，許士明，鄒惠玲

（山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心＜山東＞，山東濟(jì)南 250102）

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在適宜條件下產(chǎn)生的小分子有毒次級代謝物，目前已發(fā)現(xiàn)300多種[1]。據(jù)報(bào)道，全球每年約有25%的農(nóng)產(chǎn)品被真菌毒素污染，造成數(shù)百億美元的損失[2]。真菌毒素污染不僅發(fā)生在農(nóng)作物種植期間，在其收獲、貯存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)也會發(fā)生[3]。被污染的谷物及其制品通過食物鏈傳遞，對人、畜的肝臟、腎臟、造血系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等造成損害，部分真菌毒素還存在致癌、致畸、致細(xì)胞突變的重大危害[4]。因此，真菌毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）和聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）列為食源性疾病的三大根源之一[5-6]。真菌毒素的強(qiáng)毒性和高污染頻率，已經(jīng)成為國際社會重點(diǎn)關(guān)注研究的食品安全問題之一?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》對谷物及其制品中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的最大允許含量水平進(jìn)行了規(guī)定[7]。

目前，谷物及其制品中真菌毒素的分析主要包括樣品前處理和儀器檢測兩個(gè)環(huán)節(jié)。樣品前處理常用的方法有液液萃取技術(shù)（Liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取技術(shù)（Solid phase extraction，SPE）、QuEChERS技術(shù)、凝膠滲透色譜技術(shù)（Gel permeation chromatography，GPC）、免疫親和層析技術(shù)（Immunoaffinity chromatography，IAC）和免疫磁珠技術(shù)（Immunomagnetic microbeads，IMBs）。儀器檢測方法主要包括薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）、酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、液相色譜法（Liquid chromatography，LC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）。本文對真菌毒素殘留的前處理和檢測方法進(jìn)行了回顧，以期更好地為谷物及其制品中真菌毒素的研究提供理論指導(dǎo)。

1 谷物及其制品的前處理方法

樣品前處理技術(shù)是獲得準(zhǔn)確、可靠檢測結(jié)果的前提和保障，前處理過程包括樣品制備、提取、分離純化和濃縮等步驟，以最大程度地從復(fù)雜基質(zhì)中提取待測組分為目的[8-10]。

1.1 LLE技術(shù)

LLE技術(shù)利用液體混合物中各組分在兩相溶劑中溶解度的差異實(shí)現(xiàn)凈化提取[11-12]。根據(jù)相似相溶原理，乙腈/水或甲醇/水體系是常見的真菌毒素的提取溶劑[13]。LLE技術(shù)具有簡單快速、易于實(shí)現(xiàn)、操作快速等特點(diǎn)，但存在有機(jī)溶劑用量大、不能滿足高通量檢測需求、目標(biāo)物易流失等問題[11,14]。Soleimany等[15]利用乙腈-水-乙酸對稻米、小麥、燕麥、大麥和玉米粉進(jìn)行提取，經(jīng)LLE凈化后，同時(shí)測定黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）、OTA、ZEN、DON、伏馬毒素（FB1和FB2）、T-2毒素和HT-2毒素，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果良好。Slobodchikova等[16]以乙酸乙酯為LLE試劑對雪腐鐮刀菌烯醇、DON、AFB1等17種真菌毒素進(jìn)行凈化處理，既避免使用免疫親和柱，也大大降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響。楊琳等[17]對糧谷類食品中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素用甲醇-水提取后，以LLE方式凈化后，采用高效液相色譜法同時(shí)檢測黃曲霉毒素和赭曲霉毒素，方法簡便快速、凈化效果好，結(jié)果表明各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1.2 SPE技術(shù)

SPE技術(shù)基于液相-固相色譜分離原理，首先目標(biāo)物被吸附到合適的固體吸附劑上，通過淋洗使目標(biāo)物與干擾組分分離，再以合適的洗脫劑將目標(biāo)物從固體吸附劑上解離出來，從而達(dá)到凈化與富集目標(biāo)物的目的[9-10]。SPE技術(shù)具有操作簡單、有機(jī)試劑用量少、適用于多殘留分析等特點(diǎn)，目前用于真菌毒素的SPE方法主要采用反相固相萃取柱[18-20]和毒素專用固相萃取柱[21-22]。多功能凈化柱（Multifunctional purification column，MFC）是一種特殊的SPE小柱，它是以極性、非極性及離子交換等幾類基團(tuán)組成的復(fù)合吸附填料小柱。研究表明，MFC凈化過程簡便快速，凈化效果較好，適用于谷物及其制品中多種真菌毒素的測定[23-24]。此外，新型的分散固相萃取技術(shù)（Dispersive solid phase extraction，DSPE）也被應(yīng)用于大米中多種真菌毒素的凈化[25]。

1.3 QuEChERS技術(shù)

基于固相分散萃取原理建立的QuEChERS技術(shù)是一種具有快速、簡單、便宜、有效、可靠、安全等特征的前處理方法，被廣泛應(yīng)用于多農(nóng)藥殘留[26-27]、多獸藥殘留[28-29]、多真菌毒素[30-36]的檢測中。QuEChERS方法的建立與優(yōu)化主要從提取溶劑、鹽析劑和凈化劑幾個(gè)方面來進(jìn)行。目前，乙腈被廣泛應(yīng)用于多種真菌毒素的提取，而提取酸堿度、極性范圍敏感的真菌毒素時(shí)，需要加入輔助試劑，如乙酸、甲酸、甲醇等以增強(qiáng)提取效果[37-39]。Zhang等[38]建立了一種基于QuEChERS前處理技術(shù)同時(shí)測定谷物中多種真菌毒素的高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)果表明所建立的方法快速、可靠、簡便、靈敏，適用于谷物中多毒素的同時(shí)測定。Sospedra等[39]采用改良的QuEChERS技術(shù)對小麥粉中多種毒素進(jìn)行凈化處理，結(jié)果表明該方法具有較好的回收率，能滿足小麥粉中多種真菌毒素的檢測。QuEChERS前處理方法需要使用吸附劑，在降低基質(zhì)干擾的同時(shí)，也存在吸附目標(biāo)物進(jìn)而使回收率降低的可能性。此外，經(jīng)QuEChERS技術(shù)提取后，提取液中可能會存在共萃取雜質(zhì)對光學(xué)檢測器靈敏度產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 GPC技術(shù)

GPC技術(shù)基于物質(zhì)分子量大小，利用體積排阻機(jī)理，使分子質(zhì)量不同的目標(biāo)分析物被具有分子篩性質(zhì)的固定相分離。樣品中脂肪、色素等大分子雜質(zhì)被淋洗出來，在一定程度上降低了大分子基質(zhì)的干擾[40-41]。劉家陽等[42]將全自動(dòng)凝膠滲透色譜儀應(yīng)用于玉米粉中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等10種真菌毒素的凈化過程中，經(jīng)驗(yàn)證該方法具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，適用于玉米粉中多種真菌毒素的快速測定。宮小明等[43]以GPC技術(shù)對花生、糧油產(chǎn)品進(jìn)行凈化處理后，利用同位素稀釋法對樣品中18種真菌毒素同時(shí)測定。研究表明，所建立的檢測技術(shù)適用于多組分真菌毒素低含量的定性確證和定量檢測，滿足國際上對真菌毒素檢測的限量要求。

1.5 IAC技術(shù)

IAC技術(shù)是基于抗原抗體特異性可逆結(jié)合的原理對樣品進(jìn)行凈化，真菌毒素IAC是一種利用免疫反應(yīng)的高度特異性，以抗原或抗體的一方作為配基親和吸附另一方，從而使樣品得以凈化的分離體系[9,44]。Lattanzio等[45]利用多毒素免疫親和柱對玉米中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素等11種真菌毒素進(jìn)行凈化后，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對11種真菌毒素進(jìn)行檢測和定量分析，結(jié)果顯示所測定的11種毒素的濃度均接近或低于歐盟最高允許或建議限量值，方法具有較好的適用性。由于大多數(shù)真菌毒素是弱免疫物質(zhì)且相對分子質(zhì)量小于1 000，目前商品化的IAC種類有限[46-49]；此外，IAC凈化柱價(jià)格相對偏高，導(dǎo)致實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性[9,44]。

1.6 IMBs技術(shù)

IMBs技術(shù)將生物識別元件（如抗體）和磁性材料（如Fe3O4）偶聯(lián)結(jié)合成定向固定化免疫磁珠，利用磁場作用特異性地實(shí)現(xiàn)樣品凈化、富集的目的[50]。近年來，IMBs技術(shù)因具有簡單快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，被成功應(yīng)用于水樣、食品、中藥材中真菌毒素的凈化[51-55]。雷方等[56]通過優(yōu)化免疫磁珠定向偶聯(lián)法制備出可同時(shí)凈化小麥中玉米赤霉烯酮、T-2毒素等8種真菌毒素的免疫磁珠，所開發(fā)的免疫磁珠親和純化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法適用于小麥中多種真菌毒素的同時(shí)檢測。由于目前商業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的免疫磁珠主要靠國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，這在很大程度上限制了IMBs技術(shù)的應(yīng)用。

2 谷物及其制品中真菌毒素的檢測

目前，谷物及其制品中真菌毒素檢測技術(shù)主要有快速檢測和確證檢測兩種方法。兩類檢測方法在現(xiàn)場快速篩查和試驗(yàn)室仲裁檢測形成互補(bǔ)，為防范真菌毒素安全風(fēng)險(xiǎn)提供一定的技術(shù)支撐[10,57]。

2.1 TLC法

TLC法是較早應(yīng)用于真菌毒素檢測的色譜技術(shù)[11]，也是很多實(shí)驗(yàn)室檢測真菌毒素的常規(guī)手段。Hadiani MR等[58]采用TLC法分離鑒定玉米中玉米赤霉烯酮，方法檢出限可達(dá)到100 ng/g，且分離效果良好。由于TLC技術(shù)存在試劑消耗量大、前處理過程繁瑣、重現(xiàn)性和靈敏度不高等問題，不能滿足現(xiàn)代食品檢測高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高自動(dòng)化的要求。目前TLC方法與其他分離技術(shù)聯(lián)用逐漸成為一種趨勢，從而建立起一種更有利于定性分析和定量檢測的手段[59-60]。

2.2 ELISA法

ELISA是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本相對較低的分析方法，而ELISA法是真菌毒素檢測中常用的一種免疫分析方法[61]。Kadota等[62]建立了一種基于表面等離子體共振的免疫分析方法，用于檢測小麥中血腐鐮刀菌醇和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，結(jié)果表明該方法測得的結(jié)果與液質(zhì)測定結(jié)果一致。在實(shí)際檢測過程中，有學(xué)者提出，ELISA法可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不能進(jìn)行定量分析，常被作為初步篩選手段用于現(xiàn)場檢測篩查[63-65]。

2.3 GC-MS/MS法

GC及GC-MS/MS技術(shù)適用于分析熱穩(wěn)定、易揮發(fā)的化合物，而多數(shù)真菌毒素穩(wěn)定性好且不易揮發(fā)，因此該方法有一定的局限性，主要適用于單端孢霉烯族化合物的檢測[64,66]。Rodríguez-Carrasco等[67]利用改良的QuEChERS方法對小麥粗粉進(jìn)行前處理后，首次將氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀應(yīng)用于展青霉素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素等10種毒素的測定中。結(jié)果表明，他所建立的GC-MS/MS方法適用于小麥粗粉中多毒素的檢測，方法的定量限低于10 μg/kg，應(yīng)用于實(shí)際樣品的結(jié)果表明，方法的可檢測濃度低于真菌毒素所允許的最大水平，滿足分析要求。

2.4 LC法

LC法具有高分離性能、高靈敏度、不易受基質(zhì)干擾等特點(diǎn)，結(jié)合紫外檢測器、熒光檢測器或蒸發(fā)光檢測器可應(yīng)用于真菌毒素的檢測。謝剛等[68]采用全自動(dòng)免疫親和在線凈化技術(shù)對玉米、小麥中赭曲霉毒素A進(jìn)行前處理后，以液相色譜法進(jìn)行測定，所建立的方法滿足谷物中赭曲霉毒素A的快速定量檢測。Bascarán等[69]經(jīng)免疫親和萃取牛奶中赭曲霉毒素A后，利用液相色譜-熒光檢測法對赭曲霉毒素A含量進(jìn)行測定。Wang等[70]在無衍生化處理的情況下，利用液相色譜-蒸發(fā)光散射法對玉米中伏馬毒素B1、B2、B3、B4進(jìn)行測定，方法檢測限達(dá)3 mg/kg。目前，LC技術(shù)主要用于單一化合物或同一類型的真菌毒素的檢測，在多類型真菌毒素同時(shí)檢測時(shí)具有一定的局限性。

2.5 LC-MS法

LC-MS技術(shù)將液相色譜與質(zhì)譜結(jié)合起來使用，既具有液相色譜儀的靈敏度高、分離性能高等特點(diǎn)，也具有質(zhì)譜儀很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)解析及組分鑒定能力，實(shí)現(xiàn)了色譜高分離能力和質(zhì)譜強(qiáng)鑒定性能的優(yōu)勢互補(bǔ)，使LC-MS技術(shù)成為一種靈敏、高效、快速的檢測手段。目前，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)被廣泛用于多目標(biāo)毒素及代謝物的檢測[71-76]。鑒于LC-MS的特點(diǎn)，該技術(shù)已成為食品中多目標(biāo)毒素及代謝物檢測的定性確證和定量分析的重要手段。Zachariasova等[36]利用液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了谷物中多種鐮刀菌毒素，同位素內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)配標(biāo)均被用于定量分析中，采用飛行時(shí)間質(zhì)譜和Orbitrap兩種高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于谷物中11種鐮刀菌毒素的測定。高敬銘等[48]采用復(fù)合免疫親和柱對糧食中的6種真菌毒素進(jìn)行凈化后以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行同時(shí)檢測，方法定量準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，適用于大米、小麥等糧食中多種真菌毒素的定性定量檢測。劉拉平等[71]采用SPE凈化結(jié)合溶劑萃取技術(shù)，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在電噴霧負(fù)離子模式下對糧食中的ZEN和DON兩種毒素同時(shí)測定，實(shí)現(xiàn)了糧食產(chǎn)品中ZEN和DON毒素的同步快速分析。

3 小結(jié)

真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在適宜條件下產(chǎn)生的小分子有毒次級代謝物，其強(qiáng)毒性和高污染頻率成為影響谷物及其制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因。因此，建立高效的樣品前處理方法及快速準(zhǔn)確、高通量的多目標(biāo)毒素檢測手段成為谷物及其制品中真菌毒素定性確證和定量分析的研究重點(diǎn)，也為切實(shí)保障“舌尖上的安全”提供一定的技術(shù)支持。