降低農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素的技術(shù)

徐緯昊，劉艷明，劉建龍*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南 250014；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南 250000）

黃曲霉毒素主要是由寄生曲霉和黃曲霉產(chǎn)生的具有極強致癌效應(yīng)的劇毒天然次生代謝產(chǎn)物[1]。黃曲霉素的毒性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥，其中以B1毒性最大，在農(nóng)作物、畜禽產(chǎn)品和飼料中含量較高。當(dāng)人體一次性攝入量過大時，可發(fā)生急性中毒，出現(xiàn)急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。當(dāng)持續(xù)微量攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。黃曲霉素的致癌力居首位，是目前已知最強致癌物之一。因此，如何降低飼料原料中黃曲霉毒素含量的問題引起人們廣泛關(guān)注。

1 黃曲霉毒素的特性及危害

1.1 特性

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉在特定的環(huán)境條件下發(fā)生了復(fù)雜的酶促反應(yīng)后生物合成的劇毒次級生物代謝產(chǎn)物，在發(fā)生霉變的糧食作物及糧油制品中含量較高[2]。黃曲霉毒素B1易溶于有機溶劑，難溶于水，不溶于乙醚、石油醚等，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可以看出，其結(jié)構(gòu)中含有大環(huán)共軛體系，因此其理化性質(zhì)穩(wěn)定，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最穩(wěn)定的真菌毒素之一。黃曲霉毒素的熔點為268～269 ℃，所以在高溫和紫外照射下黃曲霉毒素很難發(fā)生分解，在酸性及中性環(huán)境下也很穩(wěn)定，只有在堿性環(huán)境中才能分解[3]。黃曲霉毒素在食品加工過程中難被破壞而造成殘留，在氣候溫暖、降雨稀少、低緯度的區(qū)域下最為常見。

1.2 危害

黃曲霉毒素屬毒性極強的致癌物質(zhì)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了17種，主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2，其中黃曲霉毒素B1毒性最強，其毒性遠(yuǎn)高于有機農(nóng)藥、氰化物及砷化物。在1993年被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)列入一級人類致癌物[4]。黃曲霉毒素為二氫呋喃香豆素的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似物，因此同時具有強毒性和高致癌性，屬食源性二級真菌毒素[5]。

1.2.1 對人類的危害

黃曲霉毒素一方面直接影響畜禽等的機體健康，同時會通過食物鏈的富集作用威脅人類健康[6]。黃曲霉毒素的毒性主要有急性毒性、慢性毒性和致癌性。急性中毒往往會發(fā)展為膽管增生、急性肝炎、肝細(xì)胞壞死，通常是誤食了被黃曲霉污染的食品的原因，不僅如此，黃曲霉毒素還會使免疫系統(tǒng)受損，導(dǎo)致兒童發(fā)育受阻。少量多次的攝入黃曲霉毒素會引起肝癌，屬于慢性毒性。黃曲霉毒素還具有致畸致癌作用，主要是因為黃曲霉毒素B1進(jìn)入人體后使癌細(xì)胞中的發(fā)揮抑癌作用參與細(xì)胞調(diào)節(jié)的p53基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，喪失其特定的生理功能，重則促進(jìn)細(xì)胞癌變；黃曲霉毒素B1在人體內(nèi)主要發(fā)生環(huán)氧化和去甲基化等代謝過程，會產(chǎn)生同樣的具有致癌、致突變的劇毒代謝產(chǎn)物，在人體內(nèi)積累到一定量后會造成生長受阻，同時會導(dǎo)致食物利用率下降、肝衰、肝損傷，逐漸發(fā)展為癌癥。

1.2.2 對糧食作物的危害

黃曲霉毒素是一種常見的絲狀真菌，主要污染糧食作物，玉米、小麥等常常受其侵害而發(fā)生霉變；還會污染動植物食品，如肉制品、奶制品、動物飼料等，而且，黃曲霉及黃曲霉毒素更喜歡侵襲脂肪含量豐富的油料作物，如花生、大豆等，其中，對花生和玉米的污染最為嚴(yán)重。玉米喜溫，最適生長溫度在30 ℃左右，黃曲霉菌的最適生長溫度為28 ℃，由于最適生長溫度相近使得玉米被黃曲霉污染的幾率提高[7]；而且玉米胚部體積較大，大約占全粒體積的三分之一，且含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，代謝旺盛，為黃曲霉提供了適宜的生長環(huán)境，因此導(dǎo)致玉米極易被黃曲霉污染，尤其是玉米的籽粒，由于黃曲霉毒素在自然條件下難以被分解，因此黃曲霉及黃曲霉毒素的污染成為我國糧食生產(chǎn)的一大安全隱患，為了有效減少污染，選用高抗的優(yōu)質(zhì)品種成為當(dāng)前研究的重點[8]。

1.2.3 對畜禽的危害

黃曲霉毒素對動物的危害主要體現(xiàn)在免疫功能、生長發(fā)育、繁殖能力等方面。黃曲霉毒素會對動物造成免疫抑制，主要作用于細(xì)胞免疫，而且能與DNA或RNA結(jié)合，同時抑制其合成，最終導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體減少[9]。簡單來說就是AFB1降低了血清中抗體和免疫球蛋白水平，削弱吞噬細(xì)胞能力，導(dǎo)致機體抵抗力下降，從而免疫失敗。大量研究表明，黃曲霉毒素會破壞飼料中的營養(yǎng)成分，若飼料中含有大量毒素則會使動物采食量降低，毒素進(jìn)入機體后能降低胰酶活性，影響激素和酶的合成，使吸收和代謝緩慢，造成動物食欲不振、消化不良、生長發(fā)育滯后等。黃曲霉毒素會導(dǎo)致畜禽的生殖器官發(fā)生病變，導(dǎo)致受精率下降、孵化率降低、胚胎死亡率增加、導(dǎo)致孕畜早產(chǎn)或流產(chǎn)等。因此，黃曲霉毒素會導(dǎo)致畜禽繁殖能力下降，直接影響經(jīng)濟效益[10]。

2 黃曲霉毒素的檢測方法

目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有三種，分別是薄層層析法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法。

2.1 薄層層析法

薄層層析法是最傳統(tǒng)的檢測黃曲霉毒素的方法，主要是利用了黃曲霉毒素B1的溶解性，雖然此方法快速又便捷，但操作步驟多、樣品預(yù)處理繁瑣、誤差偏大，現(xiàn)在基本不采用此法。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法主要是利用了不同物質(zhì)在固相和液相中分配系數(shù)的不同達(dá)到分離的目的。此法適用于多種及大量樣品的分析檢測，而且用時短、靈敏度高，但是所用設(shè)備先進(jìn)且昂貴，同時對操作技術(shù)的要求較高，因此限制了它的應(yīng)用范圍。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是迄今為止國際上認(rèn)可的科學(xué)有效的檢測黃曲霉毒素B1的方法，此法的基本原理是酶分子與抗體或抗體分子共價結(jié)合，結(jié)合后的酶標(biāo)記抗體可以跟吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合；滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體被氧化，出現(xiàn)顏色反應(yīng)，由無色變?yōu)橛猩Ｒ蚨梢酝ㄟ^底物的顏色變化來判定有無相對應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比，此種顯色反應(yīng)可通過儀器進(jìn)行定量測定。

相較于前兩種方法來說，酶聯(lián)免疫吸附法檢測成本更低、特異性更強、靈敏度和效率也相對高一些，是實驗室主要的檢測方法，同時也是國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法之一[11]。

3 黃曲霉毒素的脫毒方法

解決黃曲霉毒素問題的基本措施包括抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生及對已污染的作物進(jìn)行去毒脫毒，盡量降低黃曲霉毒素的危害。防止黃曲霉毒素的污染，脫毒只是后續(xù)的補救措施，而最根本的是抑制其產(chǎn)生，從根本上解決問題，黃曲霉毒素的脫毒方法大致包括理化去除法和生物去除法兩大類。其中理化去除法主要是利用物理和化學(xué)的方法來去除霉菌，比如篩選剔除、輻射降解、吸附、有機溶劑萃取等；生物去除法主要利用真菌細(xì)菌等微生物對黃曲霉毒素的吸附降解作用來達(dá)到脫毒的目的。

3.1 物理吸附法

物理吸附法被認(rèn)為是最經(jīng)典的脫毒方法，常用的吸附劑有活性炭、膨潤土、水合硅鋁酸鹽、酵母細(xì)胞壁等，在工業(yè)生產(chǎn)中，一般采用硅酸鹽吸附劑以及納米吸附劑來去除霉菌毒素，吸附的主要原理是利用硅酸鹽吸附劑多孔性與靜電作用，與帶有離子極性的毒素結(jié)合，從而達(dá)到去毒的目的。劉媛婷等[12]通過進(jìn)行體內(nèi)實驗、體外實驗和動物實驗，比較了5種霉菌毒素吸附劑的吸附特性以及使用效果，其中水合硅鋁酸鹽與活性炭組合吸附劑在pH6.0時吸附率達(dá)91.71%，解吸附率為15.05%，比單獨使用水合硅鋁酸鹽吸附劑高出8.06%，得出水合硅鋁酸鹽與活性炭的組合吸附劑對黃曲霉毒素的吸附效果最好。特別注意的是，有些吸附劑在吸附毒素的過程中也會吸附很多營養(yǎng)物質(zhì)，并且有可能在動物體內(nèi)代謝過程中解吸，重新暴露，對動物造成危害。因此物理吸附法應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化并明確吸附劑的代謝過程，降低解吸附率，盡可能減少吸附劑對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附。

3.2 生物吸附法

在生物脫毒法中也有利用微生物吸附霉菌毒素的方法，如乳酸菌黏附法。乳酸菌自身具有黏附作用而且其分泌的代謝產(chǎn)物也具有抑菌作用，因此其主要通過分泌的有機酸和過氧化氫等來抑制霉菌生長，從而減少黃曲霉毒素的含量。另有一部分乳酸菌可以與黃曲霉毒素構(gòu)成復(fù)合體，形成的復(fù)合體粘性降低，從而可以輕易地被排出體外，降低黃曲霉毒素的危害。GOURAMA等[13]的研究表明，市場上的青貯飼料在接種植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的混合菌種之后，表現(xiàn)出抗黃曲霉毒素的活性。最近在Oluwafemi等[14]的研究中發(fā)現(xiàn)一種從發(fā)酵玉米中提取的可以吸附黃曲霉毒素的嗜酸乳桿菌，但是當(dāng)黃曲霉毒素濃度增加，吸附效果降低31%。Lahtinen等[15]的研究表明，鼠李糖桿菌細(xì)胞壁中的肽聚糖對AFB1有較強的結(jié)合能力，但具體是哪一組分起關(guān)鍵作用目前尚未明確。此種方法沒有使用其他化學(xué)試劑，無污染且效率高。但是也有研究表明，由于此吸附作用可逆，而且毒素并沒有消失，所以隨著時間的慢慢推移，又會重新釋放出部分毒素，所以生物吸附法并不是很理想的脫毒方法。

3.3 生物降解法

其他微生物去除黃曲霉毒素的途徑主要是利用微生物及其所產(chǎn)生的酶來使毒素降解失活，失去其毒性作用，主要是真菌與細(xì)菌對黃曲霉毒素的降解作用。對黃曲霉毒素有降解作用的真菌主要有根霉、寄生曲霉、白腐真菌、黑曲霉等[16]。20世紀(jì)70年代末，Doyle等[17]發(fā)現(xiàn)了寄生曲霉代謝產(chǎn)生的過氧化物酶可以降解黃曲霉毒素B1，并且黃曲霉毒素降解率與過氧化物酶活性兩者存在正相關(guān)關(guān)系。80年代，Huynh等[18]發(fā)現(xiàn)毛霉、黑曲霉等少數(shù)真菌都對黃曲霉毒素B1具有良好的降解作用。Maris等[19]從白腐真菌與褐腐真菌中提取并純化了胞外解毒酶，胞外酶降解成為黃曲霉毒素脫毒技術(shù)研究上的熱點方向之一。劉大嶺等[20]采用基因工程技術(shù)使解毒酶在畢赤酵母成功表達(dá)，提高黃曲霉毒素解毒酶活性及穩(wěn)定性。上述研究表明，真菌降解黃曲霉素是一個復(fù)雜的過程，環(huán)境條件以及其自身因素都會對其造成影響，并且過程的可控性及穩(wěn)定性較差，降解產(chǎn)物不定向，但是研究發(fā)現(xiàn)，真菌中的單一活性成分對黃曲霉毒素有很好的降解效果。在國外的研究中，Lilleho等[21]在1966年發(fā)現(xiàn)橙色黃桿菌能夠降解黃曲霉毒素B1，Doyle等[22]證明這一能夠降解黃曲霉毒素的物質(zhì)是乳過氧化物酶，Smiley等[23]進(jìn)一步證明橙色黃桿菌降解黃曲霉毒素的機理是酶促反應(yīng)。Cserhati等[24]發(fā)現(xiàn)紅球菌能夠很好地降解黃曲霉毒素。在國內(nèi)的研究中，林峰等[25]的試驗表明，微生物對霉菌生長有一定的抑制作用，他驗證了有10株芽孢桿菌對寄生曲霉的菌絲體抑制率在80%以上，并且在試驗過后綜合篩選出7個對寄生曲霉菌絲體抑制效果良好的菌株。李俊霞等[26]發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬嗜麥芽窄食單胞菌對黃曲霉毒素有極好的降解作用，降解效率達(dá)到85.7%。關(guān)舒等[27]證明嗜麥芽窄食單胞菌是利用代謝產(chǎn)生的生物酶對黃曲霉毒素進(jìn)行降解。雷元培等[28]通過試驗研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的一種胞外酶能夠很好地降解黃曲霉毒素，起到良好的解毒作用。同時分泌的活性蛋白具有強解毒活性、特異性而且作用效果溫和，不會破壞或影響飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)，而且具強抗逆性，是去除飼料中黃曲霉毒素的一種良好途徑。

關(guān)于生物脫毒法主要有在三個，最根本的是抑制霉菌的生長從而減少毒素的產(chǎn)生和積累，二是利用微生物的吸附作用進(jìn)行脫毒，三是利用微生物或者其產(chǎn)生的胞外酶來降解黃曲霉毒素。生物脫毒法相較于其他方法來說更加溫和有效，也更環(huán)保，因此也具有更加廣闊的發(fā)展前景。

4 展望

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程、酶工程、細(xì)胞工程等手段，結(jié)合微生物應(yīng)用技術(shù)、分子生物技術(shù)等新型生物技術(shù)進(jìn)行黃曲霉毒素的脫毒防治已成為研究重點。對于目前黃曲霉毒素的防治方法中，生物防治方法對飼料營養(yǎng)物質(zhì)不造成損失，對環(huán)境無污染，而且具有特異性，能避免毒素的產(chǎn)生，因此成為當(dāng)前相對有前途和有效的方法。然而目前國內(nèi)外將生物脫毒技術(shù)應(yīng)用到飼料工業(yè)中才剛剛起步，利用生物酶降解黃曲霉毒素的關(guān)鍵在于培育出能產(chǎn)出高活性解毒酶的菌株，并且在實際應(yīng)用中創(chuàng)造出一個有利于酶促反應(yīng)的環(huán)境。因此通過各種生物技術(shù)來獲得更優(yōu)質(zhì)和適用范圍更廣的解毒酶是今后研究的方向。

減少黃曲霉毒素的根本就是抑制黃曲霉和黃曲霉毒素的產(chǎn)生，因此可以利用基因工程直接改變黃曲霉的基因序列，從而抑制黃曲霉產(chǎn)毒基因的表達(dá)，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終使黃曲霉代謝產(chǎn)物失去毒性，從根本上解決黃曲霉毒素的危害問題。