2D-LC/UV法測定苯妥英血藥濃度的臨床應用

院江麗，張寒娟，袁冬冬 （.鄭州市第七人民醫(yī)院藥學部，河南 鄭州 45006；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

苯妥英是一種傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，因其療效顯著，且鎮(zhèn)靜作用輕微，目前仍是全面強直陣攣發(fā)作的一線選用藥物[1]。由于苯妥英具有飽和性藥代動力學特點，而且治療窗很窄，安全范圍小，易發(fā)生血藥濃度過高引起的毒性反應，故需要進行血藥濃度監(jiān)測來保證其治療的安全性和有效性[2]。

隨著現(xiàn)代分離分析技術的快速發(fā)展，二維色譜技術受到了體內藥物監(jiān)測越來越多的關注和重視[3]。二維色譜能使樣品組分在兩個不同的分離條件下進行分離，顯著提高了分離能力，降低了色譜峰重疊，同時改善了色譜峰鑒定的可靠性。本研究探索二維液相色譜法在抗癲癇藥苯妥英血藥濃度監(jiān)測方面的應用，并對實驗的方法學進行驗證，旨為藥學工作者掌握新的藥物監(jiān)測方法提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

2D-LC/UV系統(tǒng)由島津LC-20AT液相色譜部件和FLC 2420全自動二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司）構成；TDZ4-WS低速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；Mini-15K微型高速離心機（杭州奧盛儀器有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；GH-202電子分析天平（日本AND公司）；醫(yī)用冰箱（合肥美菱股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苯妥英（批號：BZ150712，含量：99.0%，中國食品藥品檢定研究院）；VCV-1D移動相，BPI-1堿性流動相，API-1酸性流動相，MPI-1移動相，ACP-1去蛋白劑，ACG保護劑（均購于湖南德米特儀器有限公司）；空白馬血清；純水為怡寶純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

第一維色譜系統(tǒng)中，色譜柱：Aston SC2柱（4.6 mm×25 mm，5 μm），流動相為VCV-1D移動相（20.0 mmol·L-1磷酸銨-乙腈-甲醇= 3 : 1 : 1，磷酸調pH值至5.4），流速0.7 mL·min-1。捕集柱：Aston SH柱（3.0 mm×10 mm，5 μm），流動相為純水。第二維色譜系統(tǒng)中，色譜柱：Aston SCB柱（4.6 mm×100 mm，5 μm），流動相為BPI-1堿性流動相∶API-1酸性流動相∶MPI-1移動相= 11∶37∶52（V∶V∶V），流速1.2 mL·min-1。柱溫：40 ℃，紫外檢測波長：240 nm，采用等度洗脫，進樣量50 μL。FLC2420系統(tǒng)測定流程：樣品通過自動進樣器進樣，在第一維色譜柱進行初步分離，樣品中目標組分轉移至捕集柱中，捕集柱中的目標組分在第二維流動相淋洗下進一步分離，被后端UV檢測器檢測。本實驗時間程序設置見表1。

表1 FLC2420系統(tǒng)運行時間程序Tab 1 Time program for online column extraction of FLC2420

2.2 標準儲備液的配制

精密稱取苯妥英對照品4.98 mg，用25%異丙醇水溶液溶解并定容至10 mL，得苯妥英對照品的標準儲備液，濃度為493.02 μg·mL-1，置- 20 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 血液樣品處理方法

血液樣品低速離心（3000 r·min-1）5 min備用；準確吸取900 μL ACP-1去蛋白劑（12%高氯酸）至1.5 mL的EP管中，再準確加入300 μL血清，渦旋振蕩1 min后，高速離心（14 500 r·min-1）8 min備用；再準確吸取100 μL ACG保護劑和1000 μL上清液至1.5 mL進樣瓶中，震蕩搖勻，備用。在“2.1”色譜條件下，進樣50 μL，記錄色譜圖和峰面積，采用外標工作曲線法定量，將樣品峰面積代入標準曲線，計算所得濃度。

2.4 色譜行為考察

在上述“2.1”色譜條件下，分別對空白血樣、空白血樣中加入對照品以及受試者服藥后的血樣進行測定，結果見圖1。由圖1可知，苯妥英的保留時間在6.30 min左右，峰形較好，血清中內源性雜質峰不干擾測定，專屬性較好。

圖1 2D-LC/UV色譜圖A - 空白血樣，B - 空白血樣+苯妥英對照品，C - 受試者服藥后的血樣；1 - 苯妥英Fig 1 2D-LC/UV chromatogramA - blank serum, B - blank serum + phenytoin, C - serum after taking phenytoin; 1 - phenytoin

2.5 線性關系考察

將苯妥英標準儲備液用空白馬血清稀釋成系列濃度溶液（1.54、3.08、6.16、12.33、24.65、49.30 μg·mL-1），按“2.3”項下方法處理并測定，以苯妥英的濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制工作曲線，得到線性回歸方程為Y = 7.173 4×103X +8.718 8×103（r = 0.999 9），定量下限質量濃度為1.54 μg·mL-1（S/N＞10）。臨床上苯妥英有效血藥濃度為10 ～ 20 μg·mL-1，當血藥濃度超過20 μg·mL-1易產生毒性反應，出現(xiàn)眼球震顫，超過30 μg·mL-1出現(xiàn)共濟失調，超過40 μg·mL-1往往出現(xiàn)嚴重毒性。由此可見，所選線性范圍包含其治療濃度參考范圍和實驗室危急值，可滿足臨床測定范圍的要求。

2.6 回收率和精密度

將苯妥英標準儲備液用空白馬血清稀釋成高、中、低（49.30、12.33、3.08 μg·mL-1）3個濃度的工作液，按血液樣品處理方法，在“2.1”色譜條件下測定3次，取平均值，代入標準曲線方程計算苯妥英的血藥濃度，以實測值與加入質量濃度之比計算回收率。每個濃度設置6組平行，分別在同一天內測定6次計算日內精密度和連續(xù)6日內每日測定1次計算日間精密度。由表2的結果可知，本方法的回收率高于94%，日內、日間的精密度RSD值均小于3.53%，符合生物等效性研究的方法學要求。

表2 方法回收率及日內日間精密度. n = 6Tab 2 The recovery and intra-day and inter-day precision. n = 6

2.7 樣品穩(wěn)定性考察

將“2.6”項下的高、中、低濃度的工作液，分別在室溫下放置24 h、反復凍融3次以及- 20 ℃冰凍保存30 d后按血液樣品處理方法，在“2.1”色譜條件下，測定6次，取平均值。結果表明血漿中苯妥英穩(wěn)定性良好，RSD均小于5%，詳見表3。

表3 樣品穩(wěn)定性結果. n = 6Tab 3 The stability results of samples. n = 6

2.8 臨床應用

采集30例口服苯妥英鈉患者血清樣本進行血藥濃度檢測。要求首次服藥兩周后，下一次服藥前取靜脈血2 mL，按血液樣品處理方法，在“2.1”色譜條件下，測定苯妥英的血藥谷濃度。結果在治療窗濃度范圍（10 ～ 20 μg·mL-1）之內有19例，超過治療窗濃度范圍有6例，低于治療窗濃度范圍有5例，其中不在治療窗濃度范圍的患者占總人數(shù)的36.7%。

3 討論

苯妥英個體差異較大，一方面與其特殊的藥代動力學特征有關；另一方面與患者用藥依從性、服藥劑量、藥物相互作用、病理狀況、以及年齡存在很大的關聯(lián)[4]。不同的藥品生產廠家生物利用度也存在差異[5-6]，應關注這一情況。因此患者服用苯妥英達到維持劑量后、每次劑量調整后及更換藥品廠家后，都應當測定血藥濃度， 這不僅可以提高藥物治療效果，也可避免或減少藥品不良反應的發(fā)生。

目前苯妥英血藥濃度的測定方法[7]主要有色譜法、免疫法[8-9]和光譜分析法。高效液相色譜法因靈敏度、精密度高，專一性強，應用范圍廣，已成為血藥濃度監(jiān)測中最常用的方法[10]。但該方法對樣品的前處理要求非常高，必須完全去除大分子蛋白質及其他大分子物質，以最大程度地減少對分析柱的柱效的影響。免疫法監(jiān)測藥物濃度主要是利用蛋白競爭的原理進行監(jiān)測的，這類方法樣品處理簡單，獲取結果快，但儀器和試劑盒依賴進口，價格昂貴。紫外分光光度法專屬性差，容易受血液中其它組分的干擾，單獨應用于測定血藥濃度時常常受到限制。

本研究采用的2D-LC/UV，該法是在單分離柱基礎上發(fā)展起來的，其技術關鍵是聯(lián)結兩色譜分離系統(tǒng)之間的接口設備和技術[11]。通過色譜柱的二次分離，大大減少血中雜質的干擾，提高了檢測結果的準確度；通過捕集柱的捕獲和富集，縮短了分析時間，實現(xiàn)了樣品的快速測定。采用該方法苯妥英單個檢測樣品可在7 min內測定完畢，提高了監(jiān)測結果的反饋速度，有利于臨床醫(yī)師更好的指導合理用藥。

綜上所述，本研究建立的2D-LC/UV法測定苯妥英血藥濃度的方法，具有前處理簡單、自動化程度高、靈敏準確、快捷穩(wěn)定等特點，能滿足臨床報告及時性、準確性和測定范圍等要求，可以作為臨床監(jiān)測苯妥英血藥濃度的有效方法。