表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在缺血性腦卒中中的研究及針灸干預(yù)機(jī)制*

李文倩，李忠仁，傅淑平，儲繼紅，姜鵬君，彭擁軍△

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029)

腦卒中是當(dāng)今世界上發(fā)病率、死亡率、致殘率最高的疾病之一，是造成60歲以上人群致殘及死亡的第二大因素，全球每年約有1500萬人患有腦卒中，缺血性腦卒中占其中的87%[1]。1942年C.H.Waddington首次提出“表觀遺傳學(xué)”概念，最初定義為研究生物發(fā)育機(jī)制的學(xué)科[2]，而隨著生命科學(xué)、遺傳學(xué)等不斷發(fā)展，其概念曾多次轉(zhuǎn)變，現(xiàn)指不涉及DNA序列改變的可遺傳表型變化的研究。越來越多證據(jù)表明，表觀遺傳調(diào)控在腦缺血病理生理中起著重要作用。針灸作為中醫(yī)學(xué)的重要部分，被廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中治療的各個階段。多項(xiàng)研究表明電針在腦卒中急性期通過調(diào)節(jié)缺血區(qū)血流、抑制神經(jīng)炎癥、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管神經(jīng)發(fā)生等機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)作用，在卒中恢復(fù)期促進(jìn)功能恢復(fù)。表觀遺傳調(diào)控特點(diǎn)與中醫(yī)的整體觀念等理論契合，故基于表觀遺傳學(xué)研究針灸治療缺血性腦卒中中發(fā)揮的作用，可為該病的防治尋找新的靶標(biāo)，為針灸治療提供更多客觀科學(xué)的支撐。

1 缺血性腦卒中的表觀遺傳學(xué)機(jī)制

表觀遺傳學(xué)是在不改變DNA序列的前提下改變基因的表達(dá)或細(xì)胞的表型，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、microRNAs (miRNAs)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、非編碼RNA的干擾。研究發(fā)現(xiàn)腦卒中后的一段時期，在梗塞周圍區(qū)域會發(fā)生類似于神經(jīng)發(fā)育期的改變，神經(jīng)可塑性增加，包括血管神經(jīng)發(fā)生、少突膠質(zhì)細(xì)胞生成、突觸發(fā)生和軸突生長等，有助于缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)[3-4]，表觀遺傳學(xué)調(diào)控很可能是介導(dǎo)該過程的潛在重要機(jī)制。

1.1 DNA甲基化與缺血性腦卒中

DNA甲基化是一種可逆的表觀遺傳機(jī)制，是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化下，CpG(cytosin-guanine)二核苷酸序列中的胞嘧啶發(fā)生甲基化，通常啟動子的甲基化抑制基因的表達(dá)，而低甲基化與基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

DNA甲基化和腦卒中的發(fā)生、發(fā)展及功能預(yù)后等方面都密切相關(guān)?；蛱禺愋愿呒谆墙閷?dǎo)缺血性腦卒中發(fā)生的重要機(jī)制之一。如啟動子甲基化水平的增高抑制血管緊張素II 2型受體(AT2R)的表達(dá)，增加新生大鼠缺血缺氧后腦組織的損傷[5]。妊娠缺氧致糖皮質(zhì)激素受體(GR)基因啟動子DNA甲基化增加，使轉(zhuǎn)錄因子早期生長反應(yīng)蛋白(Early growth response protein 1，EGR1)和Sp1與GR基因啟動子的結(jié)合減少，進(jìn)而抑制大腦中GR基因表達(dá)，提高新生大鼠大腦對缺氧缺血性損傷的易感性[6]。動脈粥樣硬化作為缺血性腦卒中的重要危險因素之一，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)全基因組DNA高甲基化是其伴隨特征[7-8]。然而，亦有研究發(fā)現(xiàn)血液中DNA低甲基化與卒中發(fā)生率的增加相關(guān)[9]。

腦缺血使DNA明顯受損，同時引起基因表達(dá)的改變。缺血再灌注后的組織中DNA甲基化水平比對側(cè)大腦半球顯著增加[10]。MMP-2是缺血性腦卒中重要的調(diào)節(jié)因子之一[11-12]，由表觀遺傳學(xué)調(diào)控[13]，具有雙向調(diào)節(jié)作用，參與早期損傷和后期康復(fù)，研究發(fā)現(xiàn)男性缺血性腦卒中患者M(jìn)MP-2基因甲基化水平較低，且在小血管卒中尤為明顯[14]。DNA甲基化與神經(jīng)發(fā)生和突觸可塑性等生理修復(fù)機(jī)制有關(guān)。抑制DNA甲基化可抵抗缺血，減輕缺血及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管神經(jīng)損傷，同時特異性抑制組蛋白去乙?；痆10]。研究發(fā)現(xiàn)DNMTs抑制劑，如Zebularine、5-氮雜-2-脫氧胞苷可降低腦缺血損傷中DNA甲基化水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10,15]。此外，通過DNA甲基化測量的缺血性腦卒中患者的生物學(xué)年齡與卒中發(fā)生風(fēng)險及不良功能預(yù)后相關(guān)[16]。

1.2 組蛋白修飾與缺血性腦卒中

DNA在細(xì)胞核內(nèi)的濃縮是通過與組成核小體的4種帶正電荷的核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的[17]。組蛋白翻譯后修飾，如乙?；?、磷酸化、甲基化、泛素化等可通過影響 DNA 染色質(zhì)濃縮和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性等過程，影響基因的激活或沉默[18]。大量證據(jù)表明組蛋白修飾在調(diào)節(jié)腦缺血性損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[19]。

組蛋白乙酰化和去乙?；謩e與基因的表達(dá)和抑制相關(guān)，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)共同調(diào)控。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在缺血中心及其周圍，組蛋白H3乙?；痆20-21]以及H4乙酰化[22-23]水平普遍降低，繼而出現(xiàn)廣泛去乙酰化并造成嚴(yán)重?fù)p害，而通過抑制HDACs促使許多缺血保護(hù)相關(guān)基因的表達(dá)增強(qiáng)，減少梗死面積，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)及促進(jìn)功能恢復(fù)。腦卒中后5～7天缺血抑制HDAC2的表達(dá)可增加梗死周圍神經(jīng)元的存活和神經(jīng)可塑性以及抑制神經(jīng)炎癥，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[24]。在缺血大腦中HDAC9表達(dá)上調(diào)，而敲除HDAC9可抑制IkBa/NF-kB和MAPKs信號激活產(chǎn)生的神經(jīng)炎癥，從而減輕腦缺血損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，靶向 HDAC9可能是治療缺血性卒中的有效策略[25]。抑制HDAC3致H3K9的乙?；缴?，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)基因(Hspa1a, Bcl2l1, Prdx2)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺血損傷的耐受[26]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和SUV39H1在誘導(dǎo)腦缺血損傷中具有關(guān)鍵作用，而抑制G9a和SUV39H1可以通過增加缺血后腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)啟動子區(qū)域的H3K9乙?；剑险{(diào)BDNF表達(dá)，增加神經(jīng)元的存活，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[27]。缺血再灌注損傷可激活細(xì)胞凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[28]。Bax和Caspase-3是腦缺血時神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要啟動子，組蛋白去甲基化酶含Jumonji結(jié)構(gòu)域蛋白3(Jumonji domain containing proteins-3, JMJD3),通過催化H3K27me3去甲基化，激活兩者的表達(dá)，啟動神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制，而抑制JMJD3可減少梗死面積并改善神經(jīng)功能缺損，是保護(hù)腦卒中后神經(jīng)元免于凋亡的潛在治療靶點(diǎn)[29]。

1.3 miRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)與缺血性腦卒中

miRNAs是一種數(shù)量豐富而小的(20～25個核苷酸)非編碼RNA，通過阻斷信使RNA向蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[30]，它既是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)育過程中重要的調(diào)節(jié)因子，同時也在各種CNS損傷中被調(diào)節(jié)，在血管生成、神經(jīng)發(fā)生、少突發(fā)生和軸突生長中發(fā)揮重要作用[31]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs廣泛參與腦卒中后的細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、血腦屏障完整性、神經(jīng)血管發(fā)生等病理生理過程[32]，這也使miRNAs成為潛在的治療靶點(diǎn)。在缺血后的大腦及血液中的miRNAs表達(dá)發(fā)生改變，且特定的miRNAs在CNS中具有獨(dú)特的細(xì)胞特異性時間表達(dá)模式[33]。因此確定不同miRNAs在腦卒中的各個階段及區(qū)域的表達(dá)十分重要。

1.3.1 miRNAs可作為生物標(biāo)志物 血液中的miRNAs可作為診斷和治療缺血性腦卒中以及判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物[34]。miRNA-125b-2*、miRNA-27a*、miRNA-422a、miRNA-488和miRNA-627在腦卒中急性期中一致上調(diào)，且不受性別、年齡及其他干擾因素影響[35]。miRNA-125a-5p、miRNA-125b-5p和miRNA-143-3p的表達(dá)在腦卒中急性期特異性升高，且敏感度高于CT[36]。此外， miRNA-21[35-37]、miRNA-24[37]、miRNA -210[38]、miRNA-221[39]、miRNA-145[40]等亦或?yàn)槟X卒中診斷的潛在生物標(biāo)志物。

1.3.2 miRNAs與細(xì)胞死亡 腦損傷的增加和細(xì)胞凋亡的增加有關(guān)。其中，Bcl-2蛋白家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡中具有關(guān)鍵作用。miRNA-181a在缺血中心表達(dá)增加，但在缺血半暗帶減少，抑制miRNA-181a可通過上調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞死亡[41]；抑制miRNA-497、miRNA-15a/16-1亦可增加缺血梗死組織中bcl-2和bcl-w的表達(dá)，減少梗死面積并改善神經(jīng)功能預(yù)后[42-43]。胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化和存活，是真核細(xì)胞中最有效的抗細(xì)胞凋亡生長因子之一。抑制miRNA-186-5p、miRNA-320、miRNA-1等可通過調(diào)節(jié)IGF-1通路，抑制細(xì)胞凋亡，顯著減少梗死面積，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[44-46]。而上調(diào)miRNA-381靶向LRRC4基因可減少神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)[47]。

1.3.3 miRNAs與神經(jīng)炎癥 miRNA let7i在缺血性腦卒中急性期的表達(dá)下降，且和梗死嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，可通過靶向CD86、CXCL8、HMGB1基因，調(diào)控白細(xì)胞的增殖、活化與募集，為調(diào)節(jié)卒中后炎癥反應(yīng)的潛在靶點(diǎn)[48]。缺血性腦卒中急性期大腦中的miRNA-210水平增加，抑制miRNA-210可下調(diào)促炎癥因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)和趨化因子(CCL2,CCL3)的表達(dá)，減輕缺血后的炎癥反應(yīng)，改善腦損傷[49]。腦缺血后miR-3473b通過靶向細(xì)胞因子信號抑制物-3(Suppressor of cytokine signaling-3, SOCS-3)基因，增加小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥損傷，抑制miR-3473b或潛在治療靶點(diǎn)[50]。

1.3.4 miRNAs與腦水腫 缺血性腦卒中可引起血腦屏障功能障礙，其最常見的并發(fā)癥是腦水腫，而維持血腦屏障的完整性可減輕腦損傷。基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)在缺血性腦卒中中的表達(dá)顯著增加，和神經(jīng)元損傷、細(xì)胞凋亡、血腦屏障開放后的腦水腫及缺血再灌注傷等相關(guān)，多種miRNAs可調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)，如miRNA-539可通過抑制MMP-9的表達(dá)，降低血腦屏障的通透性，減輕缺血再灌注損傷[51]。缺血顯著增加microRNA-130a水平，抑制miR-130a可減輕腦水腫，降低血腦屏障的通透性，減少梗塞體積，改善神經(jīng)功能[52]。

1.3.5 miRNAs與神經(jīng)血管發(fā)生 miRNA-124a[53]及miRNA-210[54]通過靶向Notch信號通路分別促進(jìn)卒中后神經(jīng)及血管生成；miRNA-133b通過來自間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的外泌體轉(zhuǎn)至神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，調(diào)節(jié)基因表達(dá)而促進(jìn)卒中后功能恢復(fù)和軸突重塑[55]。缺血大腦中miR-365的表達(dá)顯著增加，通過靶向Pax6抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化，而敲除miR-365可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生并減輕神經(jīng)元損傷[56]。miR-199a可抑制低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)，而長鏈非編碼RNA(long nocoding RNA, lncRNA) Snhg1靶向抑制miR-199a促進(jìn)血管生成[57]。

2 針灸通過表觀遺傳調(diào)控治療缺血性腦卒中

中醫(yī)“天人合一”的思想和“整體衡動”的思維模式，與表觀遺傳調(diào)控隨外部環(huán)境變化出現(xiàn)可逆性改變的特性有異曲同工之妙。盧圣峰等[58]將表觀遺傳學(xué)應(yīng)用與針灸理論之中，提出中醫(yī)的陰陽轉(zhuǎn)化與組蛋白的乙?；?、去乙酰化之間的關(guān)系，有助于深入闡述針灸的理、法、方、穴、術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)。但目前關(guān)于針灸從表觀遺傳調(diào)控治療缺血性腦卒中的研究尚處于初期階段，相關(guān)文獻(xiàn)報道不多。如通督調(diào)神法預(yù)處理可能通過上調(diào)miRNA-290、miRNA-494的表達(dá)，降低水通道蛋白4(Aquaporin4,APQ4)相對表達(dá)量，亦可通過調(diào)控miRNA-664的表達(dá)，降低MMP-9相對表達(dá)量，誘導(dǎo)腦缺血耐受，減輕腦水腫而實(shí)現(xiàn)腦保護(hù)[59-60]。配對免疫球蛋白樣受體(Paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)參與抑制腦卒中后軸突再生，而電針可以增加缺血半暗帶中的miRNA-181b水平，并通過miRNA-181b直接靶向PirB mRNA來調(diào)節(jié)PirB、RhoA和GAP43的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)行為功能恢復(fù)[61]。此外，miRNA-9和炎癥因子的分泌呈負(fù)相關(guān)，在 NF-кB信號通路中至關(guān)重要，后者是介導(dǎo)或加劇腦缺血后炎癥損傷的中心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)電針曲池、足三里可能通過上調(diào)miRNA-9的表達(dá)，調(diào)控NF-κB信號通路，抑制信號通路相關(guān)促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 及IL-6的分泌，從而對抗腦缺血再灌注損傷[62-63]。針刺百會、足三里可通過上調(diào)miRNA-124、抑制層粘連蛋白和整合素β1的表達(dá)而減少缺血再灌注大鼠的梗死面積及神經(jīng)功能損害[64]。電針亦可上調(diào)miRNA-132，靶向抑制SOX2基因的表達(dá)，促進(jìn)腦卒中后軸突再生及神經(jīng)行為功能恢復(fù)[65]。在心肌缺血大鼠的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)電針可通過上調(diào)VEGF啟動子處的H3K9乙?；?，增加VEGF的表達(dá)，從而誘導(dǎo)血管生成[66]，而根據(jù)前文所述的H3K9乙?；脚c神經(jīng)保護(hù)作用的相關(guān)性，該靶點(diǎn)或針灸治療缺血性腦卒中的潛在機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。

3 展望

雖然近年來隨著卒中單元的建立，對缺血性腦卒中超急性期的干預(yù)降低了死亡率，但在神經(jīng)保護(hù)和康復(fù)治療方面仍面臨很大挑戰(zhàn)。而在2010年進(jìn)行的1項(xiàng)隨機(jī)化系統(tǒng)研究和薈萃分析指出，針灸可有效地促進(jìn)腦卒中后的恢復(fù)[67]。關(guān)于針灸干預(yù)缺血性腦卒中，介導(dǎo)缺血耐受、神經(jīng)保護(hù)、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)血管發(fā)生及功能恢復(fù)等多種表觀遺傳學(xué)機(jī)制的研究尚處于初期階段，但基于理論分析及目前提出的各種相關(guān)假說和研究發(fā)現(xiàn)來看，表觀遺傳學(xué)的研究不僅有助于進(jìn)一步了解缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，而且有利于該病的早期診斷，并為針灸理論提供更客觀科學(xué)的支持，為其臨床應(yīng)用提供新的證據(jù)。但兩者在各自發(fā)展和結(jié)合過程中均面臨諸多問題與挑戰(zhàn)，目前表觀遺傳學(xué)主要包含上述幾種調(diào)控方式，各方式在大腦的生理、病理過程和適應(yīng)性反應(yīng)中協(xié)同作用，但之間的相互關(guān)系和影響機(jī)制尚不明確，或仍存在未知調(diào)控方式的可能；此外，表觀遺傳學(xué)和中醫(yī)理論雖有相似滲透之處，但兩者又是不同的理論體系，如何有機(jī)結(jié)合需要進(jìn)一步思考和探索。針灸干預(yù)缺血性腦卒中的機(jī)制研究及臨床療效已經(jīng)大量文獻(xiàn)報道，但在基因水平關(guān)于其通過作用于哪些位點(diǎn)，如何影響基因表達(dá)的研究尚少，目前僅在動物實(shí)驗(yàn)中初步證實(shí)了某些基因調(diào)控位點(diǎn)，但在臨床試驗(yàn)中能否通過針刺相關(guān)穴位作用于相同的位點(diǎn)、激活相同的通路、產(chǎn)生相同的調(diào)控作用，還需要今后進(jìn)一步深入驗(yàn)證。若能通過表觀遺傳調(diào)控機(jī)制客觀闡述針灸干預(yù)缺血性腦卒中的作用機(jī)制，勢必為針灸臨床應(yīng)用提供更有力的科學(xué)理論支撐，更為針灸的發(fā)展和推廣帶來新的契機(jī)。