非編碼RNA調(diào)控Kupffer細(xì)胞極化干預(yù)肝癌癌前病變惡變的研究進(jìn)展

侯嬋，魏海梁，李京濤，閆曙光，周軍

0 引言

世界衛(wèi)生組織于1978年首次給予“癌前病變”明確的定義：是一種更容易發(fā)生惡性腫瘤的組織學(xué)改變。癌前病變是某些具有潛在癌變可能性的良性病變，如長期不能治愈，這類病變可能會惡變?yōu)榘1]。肝癌癌前病變主要是指從肝硬化演變?yōu)楦伟┑闹虚g階段，肝細(xì)胞不典型增生是肝癌癌前病變和肝癌發(fā)病的相似病理因素。在2015年制定的《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診療指南》中將肝癌癌前病變的病理類型分為以下幾種：肝細(xì)胞異型增生、異型增生灶和低度異型增生結(jié)節(jié)（LGDN）、高度異型增生結(jié)節(jié)（HGDN）、肝細(xì)胞腺瘤（HCA）[2]。但是，肝癌癌前病變惡變的機(jī)制尚不十分清楚，目前普遍認(rèn)為：（1）肝癌癌前病變細(xì)胞的發(fā)生是形成肝癌的起始因素；（2）炎性纖維化微環(huán)境是導(dǎo)致肝癌形成的驅(qū)動因素；（3）肝癌癌前病變細(xì)胞與炎性纖維化微環(huán)境之間的相互作用最終促進(jìn)了肝癌的形成[3]。

肝臟中的巨噬細(xì)胞是維系肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對病理變化的重要組分。近年來諸多研究證實，巨噬細(xì)胞具有高可塑性和多功能性，在體內(nèi)和體外不同微環(huán)境影響下，可向不同的表型分化，表現(xiàn)出功能差異，此種現(xiàn)象稱為極化[4]。巨噬細(xì)胞的極化與炎性反應(yīng)、腫瘤和代謝疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells, KCs）是位于肝竇中的特殊巨噬細(xì)胞，其處于血流入肝的位置，占單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞系總數(shù)的80%～90%。KCs的表面具有特殊的功能表型，可防御經(jīng)腸道來源的病毒、細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物的侵襲，KCs分泌細(xì)胞因子，避免過度的炎性免疫反應(yīng)，并維持肝臟環(huán)境的體內(nèi)平衡。作為肝癌微環(huán)境的特殊組成部分，KCs在肝癌癌前病變的惡變中亦起著關(guān)鍵作用。

1 KCs極化與免疫作用

1.1 KCs極化

KCs表面的膜受體包括Toll樣受體（TLR）、NOD樣受體、清道夫受體、補(bǔ)體識別和Fc片段受體。KCs通過模式識別受體（pattern recognition receptor, PRR）識別機(jī)體內(nèi)、外源性的危險信號[5]。根據(jù)對輔助性T細(xì)胞的激活途徑進(jìn)行分類，當(dāng)KCs被細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、干擾素γ（interferon-γ, IFN-γ）或者白介素4（interleukin4, IL-4）/IL-13等刺激時，會出現(xiàn)兩種不同的激活類型，即M1型和M2型[6]。M1型KCs是指巨噬細(xì)胞不具有Th1細(xì)胞的抗原特異性活化并被其分泌的IFN-γ進(jìn)一步活化的KCs，此過程也稱為KCs的經(jīng)典激活途徑。M1型KCs可調(diào)控Th1型免疫應(yīng)答、殺死細(xì)胞內(nèi)病原體和抑制腫瘤生長等作用。M2型KCs被Th2分泌的IL-4和IL-13選擇性地激活，并能增加MHCⅡ抗原的表達(dá)，清除細(xì)胞表面的甘露糖配體，下調(diào)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，這是KCs的另一種替代激活途徑。M2型KCs的主要作用是參與Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)組織重塑和腫瘤發(fā)展[7]。

1.2 KCs的極化與肝癌癌前病變惡變的關(guān)系

肝臟在損傷或炎性反應(yīng)時可激活KCs，激活的KCs可釋放大量的超氧化物和活性氧，這些物質(zhì)對肝臟細(xì)胞及其基因的毒性作用可能導(dǎo)致肝臟細(xì)胞大量死亡和存活肝細(xì)胞的大量增殖，因此，它是促進(jìn)肝癌癌前病變形成和演進(jìn)的重要因素。KCs通過自分泌和旁分泌模式釋放巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF），抑制其自身的組織穿透力，與癌旁組織相比，癌組織中KCs細(xì)胞數(shù)量減少。此外，MIF刺激血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤新生血管生成，這有利于癌細(xì)胞的增殖。 因此，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，KCs的作用具有二重性，既具有顯著的抗腫瘤作用，也對原發(fā)性及轉(zhuǎn)移性肝癌的發(fā)展有一定的促進(jìn)作用。

肝組織中的KCs被來自腸道的LPS等物質(zhì)激活而極化[8]，活化的M1型KCs分泌促炎細(xì)胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-23等，可促進(jìn)局部炎性細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)，并促進(jìn)肝細(xì)胞的非典型增生性修復(fù)；M1型KCs也可通過吞噬作用將肝臟內(nèi)不典型增生的肝細(xì)胞吞噬，不典型增生的肝細(xì)胞與KCs內(nèi)的溶解細(xì)胞酶結(jié)合后被殺死。研究發(fā)現(xiàn)M1型KCs產(chǎn)生大量炎癥因子，通過釋放活性氧和氮中間體可以殺死肝臟非典型增生細(xì)胞并激活適應(yīng)性免疫。M1型KCs分泌的TNF-α和IL-1β可募集細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）以攻擊肝臟非典型增生細(xì)胞；TNF-α對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有直接殺傷作用，可激活局部單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[9]，且活化的NK細(xì)胞能分泌大量的細(xì)胞因子，抑制肝癌癌前病變的惡變，發(fā)揮其抗腫瘤作用；活化的NK細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)KCs的功能，增強(qiáng)其對肝臟非典型增生細(xì)胞的殺傷作用，也可抑制肝癌癌前病變的惡性轉(zhuǎn)化。由M2分泌的TGF-β1可有效激活肝星狀細(xì)胞（HSC）并維持其活性，活化的HSC增殖成肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，同時合成釋放大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）。TIMP可以降低間質(zhì)膠原酶活性，減少ECM降解，導(dǎo)致ECM大量積聚，促使形成肝癌癌前病變細(xì)胞、炎性纖維化微環(huán)境及相互作用，甚至進(jìn)展為肝癌[10]。同時，活化的M2型KCs分泌促血管生成因子，如VEGF、血小板源性生長因子（PDGF）、TGF-β、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）和血管生成趨化因子，并促進(jìn)肝癌癌前病變周圍異常血管增生。 M2型KCs可誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，促進(jìn)組織修復(fù)和血管新生、對炎性刺激不敏感，并具有低吞噬殺菌作用和抗原提呈能力，可導(dǎo)致肝臟非典型增生細(xì)胞免疫逃逸，促進(jìn)肝癌癌前病變向肝癌發(fā)展。因此，在肝癌癌前病變惡變防治中，可適當(dāng)調(diào)控KCs向M1型極化，抑制M2型KCs的極化，從而調(diào)控肝癌癌前病變的進(jìn)展。

2 非編碼RNA與肝癌癌前病變惡變的關(guān)系

2.1 非編碼RNA

微小RNA（microRNA, miRNA）有兩種類型：非蛋白質(zhì)編碼的miRNA和蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)含子miRNA。miRNA在生命體中的作用非同小可，可調(diào)節(jié)人類約30%～90%的基因。其中，占絕大數(shù)的是非蛋白編碼的miRNA，它是一類堿基長度為19～24 bp的內(nèi)源性非編碼RNA分子，一般位于編碼基因的外圍。非蛋白質(zhì)編碼的miRNA的功能主要與靶mRNA序列的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）相關(guān)，通過與3'UTR的堿基互補(bǔ)配對導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。一個miRNA可調(diào)節(jié)多個靶基因，幾種 miRNA也可共同調(diào)控單個基因的表達(dá)，在miRNA和靶基因之間形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[11]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與多種生理過程的調(diào)控，如發(fā)育調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡等，許多miRNA在B、T淋巴細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞和其他類型免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化、存活和功能成熟中起著重要作用[12]。

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNAs,LncRNAs）是由基因組中非編碼序列轉(zhuǎn)錄生成的、長度大于200 nt、不具有翻譯成蛋白質(zhì)能力的RNA，它的異常表達(dá)或突變與惡性腫瘤的產(chǎn)生休戚相關(guān)[13]。LncRNAs在結(jié)構(gòu)上缺乏顯著的開放閱讀框架，具有類似于mRNA的結(jié)構(gòu)特征，包括5'末端帽、3'末端的多腺苷酸化尾部、外顯子、內(nèi)含子和剪接位點。LncRNA通過多種生物過程，例如染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾和RNA代謝等來調(diào)節(jié)基因在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)。最近的研究表明，LncRNAs可通過干預(yù)腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化來調(diào)控免疫細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)免疫相關(guān)細(xì)胞因子和相關(guān)通路的表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)及腫瘤相關(guān)的免疫微環(huán)境[14]。

2.2 miRNA對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用

miRNA主要參與巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，KCs作為肝臟中一種特殊類型的巨噬細(xì)胞，在肝癌形成中的作用具有巨噬細(xì)胞的共同屬性。研究表明，不同外部因素如LPS或IL-4等刺激巨噬細(xì)胞可以影響巨噬細(xì)胞中某些miRNA的表達(dá)水平。

2.2.1 促進(jìn)M1型KCs極化的miRNA: （1） miR-29b和miR-125a-5p：巨噬細(xì)胞極化和肝臟炎性反應(yīng)主要依賴于核轉(zhuǎn)錄因子Kappa B（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）信號通路的激活，腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3（TNF-α誘導(dǎo)蛋白3, TNFAIP3）是NF-κB信號通路的抑制劑[15]。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b和miR-125a-5p可改變KCs極化通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，其過表達(dá)可特異性抑制人單核細(xì)胞系中的TNFAIP3，使M1型KCs的表達(dá)增加，參與調(diào)控KCs極化。（2） miR-223：研究證實，LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中miR-223的表達(dá)，miR-223的高表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，同時也可通過靶向抑制Pknox1促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞的極化。（3） let-7c：let-7c也是一種miRNA。Banerjee等[16]證實，let-7c可作為C/EBPδ的抑制劑，其靶向抑制C/EBPδ表達(dá)并調(diào)控巨噬細(xì)胞KCs極化：在KCs中，let-7c的過表達(dá)促進(jìn)KCs向M1的極化，抑制其表達(dá)后則極化為M2型KCs，且let-7c表達(dá)在M1型KCs和M2型KCs的動態(tài)轉(zhuǎn)變中發(fā)生變化。

2.2.2 抑制M2型KCs極化的miRNA: （1） miR-19a-3p：研究證實，miR-19a-3p在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）中表達(dá)明顯下降。TAM是浸潤在腫瘤周圍的巨噬細(xì)胞，其促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，并表現(xiàn)出M2巨噬細(xì)胞表型[17]。Fos相關(guān)抗原1（Far-1）是一種原癌基因，也是誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化的重要因子。研究證實，miR-19a-3p通過靶向抑制Fra-1并抑制其下游基因VEGF、STAT3和p-STAT3來抑制M2巨噬細(xì)胞的極化[18]。（2）miR-155：Martinez-Nunez等[19]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可靶向調(diào)控M2型KCs極化途徑相關(guān)因子信號通路中Smad2的IL-13受體α1和TGF-β表達(dá)，通過抑制IL-13受體α1和TGF-β來抑制KCs向M2型極化。同時miR-155是TLR信號通路上MyD88蛋白的抑制劑，miR-155通過抑制MyD88蛋白的表達(dá)，從而抑制KCs向M2型極化，促進(jìn)M1型KCs的極化。若抑制miR-155的表達(dá)，可促進(jìn)其靶基因C/EBPβ的表達(dá)并促進(jìn)M2型KCs的極化。（3）miR-146a：Boldin等[20]發(fā)現(xiàn)miR-146a的過表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的一氧化氮合酶（iNOS）的增加，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的極化；抑制其表達(dá)將恢復(fù)iNOS的表達(dá)，使M1型巨噬細(xì)胞極化增加。（4）miR-142-3p：Xu等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p是TGF-β信號通路調(diào)節(jié)因子之一，M2型巨噬細(xì)胞中miR-142-3p的過表達(dá)選擇性地誘導(dǎo)TGF-β受體1的表達(dá)，引起M2型細(xì)胞凋亡并抑制M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。

2.3 LncRNA對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用

文獻(xiàn)報道，LncRNAs的異常表達(dá)也影響免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育和功能。在巨噬細(xì)胞中，LncRNAs通過調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)及細(xì)胞因子的分泌來影響腫瘤免疫微環(huán)境的炎性反應(yīng)[14]。巨噬細(xì)胞可以通過分泌相關(guān)細(xì)胞因子如TNF-α等來殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，THRIL是TNF-α和hnRNPL相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)LncRNA。Atianand等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在單核細(xì)胞中，THRIL與hnRNPL的相互作用可影響TNF-α的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響肝臟中的巨噬細(xì)胞KCs的極化。Huang等[23]通過實驗研究證實，在M1型巨噬細(xì)胞中，LncRNA TCONS-00019715的表達(dá)高于M2型KCs，當(dāng)它被敲低時，M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)降低；M2型標(biāo)志物高表達(dá)，證明TCONS-00019715在KCs極化中起著重要作用。因此，外源誘導(dǎo)的LncRNA表達(dá)增加可以將TAM轉(zhuǎn)化為M1型，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對肝癌癌前病變惡變的預(yù)防和治療。在肝癌癌前病變微環(huán)境中，LncRNAs可通過調(diào)控KCs的發(fā)育、分化及極化來影響肝癌癌前病變微環(huán)境的免疫應(yīng)答。

LncRNA-ATB是LncRNA信號通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，TGF-β是LncRNA-ATB的激活因子，激活的LncRNA-ATB可促進(jìn)KCs向M2型極化，并激活HSC。M2型KCs具有促進(jìn)組織修復(fù)和血管生成的功能，并且活化的HSC與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，抑制LncRNA-ATB的表達(dá)，則極化為M1型KCs增加，表現(xiàn)為抗腫瘤作用。此外，LncRNAATB與肝硬化發(fā)生和HCC血管侵襲呈正相關(guān)。姚芳苡等[24]通過體外培養(yǎng)人巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，LncRNA NEAT1參與KCs極化的調(diào)節(jié)，在M1型KCs中高表達(dá)，高表達(dá)的LncRNA NEAT1可有效抑制KCs向M2型極化，并可誘導(dǎo)M2型KCs重極化為M1型。長鏈非編碼RNA E330013 P06的過表達(dá)可誘導(dǎo)KCs中IL-6、TNF-α和其他炎癥基因的高表達(dá)以及IL-10的低表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗炎和抗腫瘤作用。LncRNA-cox2可介導(dǎo)KCs中不同類別免疫基因的激活和抑制，并在細(xì)胞的初級免疫應(yīng)答中起重要作用。因此，在癌前病變的微環(huán)境中，LncRNAs可通過調(diào)節(jié)KCs的發(fā)育、分化和極化來影響癌前病變微環(huán)境的免疫應(yīng)答。

綜上所述，多種非編碼RNA均可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化方向，通過抑制M2型巨噬細(xì)胞極化或促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮減輕肝癌癌前病變細(xì)胞形成過程中炎性微環(huán)境的形成和殺滅癌前病變細(xì)胞，起到抑制肝癌癌前病變惡變的作用。

3 總結(jié)

我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)，新發(fā)病例占全球的55%左右，盡管目前發(fā)展了許多治療肝癌的方法和技術(shù)，如手術(shù)切除、射頻消融、肝動脈化療栓塞、三維適形放療等，但肝癌的復(fù)發(fā)率及死亡率仍居高不下，即使是根治性手術(shù)，5年內(nèi)仍有超過半數(shù)的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。癌前病變是臨床上常見的組織學(xué)變化，其向惡性腫瘤進(jìn)展的風(fēng)險遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他非惡性組織[25-26]。肝癌癌前病變尚處于可控、可逆的階段，若在肝癌前病變惡變?yōu)楦伟┲罢业娇煽坑行У闹委煼椒?，干預(yù)與其發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腫瘤微環(huán)境，就有可能顯著地抑制癌前病變的惡變，從而降低肝癌的發(fā)生率[27]。

大量研究證實，KCs的極化與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，在不同的微環(huán)境刺激下，可向不同的表型極化，從而影響著肝癌癌前病變的惡變。而miRNAs及LncRNAs兩種非編碼RNA均可通過干預(yù)KCs相關(guān)細(xì)胞因子的分泌或蛋白基因的表達(dá)，影響腫瘤炎性微環(huán)境成分，調(diào)控KCs的極化方向，促進(jìn)其向M1型極化，從而發(fā)揮增強(qiáng)免疫應(yīng)答、抑制腫瘤生長等作用，抑制肝癌癌前病變惡變。故而，研究非編碼RNAs靶向調(diào)控KCs極化干預(yù)肝癌癌前病變惡變的機(jī)制和治療藥物十分重要，期望探索到能有效調(diào)控肝癌癌前病變發(fā)生發(fā)展的非編碼RNA，抑制肝癌癌前病變的惡變，降低肝癌的發(fā)生率。