AMPK介導運動改善2型糖尿病骨代謝紊亂的明星分子

陳祥和 余慧琳 徐帥 楊康 張憲亮 趙仁清 孫開宏

1. 揚州大學體育學院，江蘇 揚州 225127 2. 淮陰師范學院體育學院，江蘇 淮安 223001 3. 山東大學體育學院，山東 濟南 250000 4. 揚州職業(yè)大學體育學院，江蘇 揚州 225127

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)作為因能量代謝紊亂導致的繼發(fā)性疾病，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和高血糖將引起組織器官結構及功能受損，導致骨質疏松等并發(fā)癥發(fā)生[1]。骨細胞分泌的非羧基化骨鈣素(uncarboxylated osteocalcin，ucOCN)可調控葡萄糖及脂肪轉化和利用，影響能量代謝；同時能量代謝亦通過反饋環(huán)路：瘦素-下丘腦-交感神經調節(jié)骨形成，影響骨代謝[2]。AMP依賴蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase，AMPK)是能量代謝關鍵調節(jié)器，其α亞基N-末端含有保守絲氨酸(serine，Ser)/蘇氨酸(threonine，Thr)激酶區(qū)，該區(qū)域保守Thr-172位點被磷酸化后激活下游相應信號途徑來調控骨代謝、能量代謝、心血管系統(tǒng)等。

T2DM骨代謝紊亂發(fā)生中，破骨細胞(osteoblast，OC)分化及骨吸收異常高于成骨細胞(osteoblast，OB)主導的骨形成。而OB或OC分化及功能發(fā)揮均是高耗能(即消耗ATP)過程，ATP/AMP比值下降激活OB和OC內AMPKα表達[3]。而敲除AMPKα后會骨代謝紊亂，但敲除β和γ亞基對骨的影響不顯著。運動是改善T2DM骨代謝紊亂的有效手段，可顯著促進OB分化及骨形成并抑制OC分化及骨吸收。而不同方式運動因對骨產生的力學刺激方式不同(直接作用力和間接作用力)，故對骨產生的作用效果存在較大差異。直接作用力促骨形成、抑制骨吸收的作用效果顯著優(yōu)于間接作用力，且可顯著上調骨中AMPK表達[4]。然而，有關不同方式運動通過調控AMPK介導T2DM OB或OC分化及功能的相關研究有待揭示。故本研究對AMPK在運動影響T2DM OB和/或OC分化及功能的相關研究進行梳理，以期闡明能量代謝在T2DM骨代謝中的作用機制，為AMPK介導運動改善T2DM骨代謝的分子機制提供一定的理論基礎。

1 AMPK簡介

AMPK由催化亞基α及調節(jié)亞基β和γ構成，可調控糖/脂代謝、線粒體功能、IR、細胞自噬、神經功能等生理過程[5-6]。骨代謝中，各AMPK亞型所扮演的角色不同。研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1-/-小鼠松質骨和皮質骨骨體積分數(shù)(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨面積和橫截面積等骨組織形態(tài)計量學指標顯著下降；AMPKα2-/-敲除小鼠脛骨骨量變化卻不顯著[7]。AMPKβ1-/-小鼠松質骨BV/TV和Tb.Th顯著下降，而皮質骨骨組織形態(tài)計量學參數(shù)變化不顯著，AMPKβ2-/-小鼠骨組織形態(tài)相關指標變化無差異[8]。有關AMPKγ介導骨代謝的相關研究尚待揭示。上述研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1亞基介導T2DM骨代謝紊亂發(fā)生，其他亞基作用不顯著。

2 T2DM導致骨代謝紊亂發(fā)生

T2DM骨代謝紊亂發(fā)生與高血糖、IR等導致的OB分化及骨形成下降和OC分化及骨吸收能力異常升高密切相關。并且，該過程受關鍵分子、激素等調控。高血糖造成低血鈣、鎂導致甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)分泌增加，抑制核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，激活核因子κB受體激活因子(nuclear factor kappa B receptor activator，RANK)，促進OC分化及骨吸收[9]。亦可通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)/Smads信號途徑、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGFs)及激活白介素-6(interleukin, IL-6)來抑制OB分化及其凋亡[10]。并且，高血糖導致糖基化終末產物(glycosylation end product, AGEs)增多，抑制OB增殖及骨形成的同時并作用于AGEs受體，產生IL-1等促進OC分化，導致骨吸收增強[11]。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素分泌減少及IR導致OB分化和骨形成能力及OC骨吸收能力增強，骨重塑下降，骨中有機質Ⅰ型膠原蛋白(type I collagen，Col1)等有機質減少，無機質流失，骨質疏松發(fā)生[12]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)途徑、核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途徑、microRNA等信號途徑激活，上調組織蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)、活化T細胞核因子c1(activated T cell nuclear factor c1，NFATc1)、激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)等并下調Runx2、Col1、PHEX等表達進而調控OC分化和骨吸收能力及OB分化和骨形成能力，抑制骨重塑，導致T2DM骨質疏松[13-14]。T2DM機體內性激素分泌減少及脂肪細胞分泌產生的瘦素增多，亦導致骨基質和骨量減少[15]。近來發(fā)現(xiàn)，能量代謝紊亂介導T2DM骨質疏松。AMPK作為調控能量代謝的關鍵酶，與沉默信息調節(jié)因子(silent information regulator 1, SIRT1)結合后調控下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、輔助激活因子-1α(PPARγcoactivator -1α, PGC-1α)等能量代謝調控因子，作用于OB和OC分化及功能，調控骨代謝[16]。然而，有關AMPK介導T2DM骨代謝紊亂的研究卻較少。

3 AMPK介導T2DM骨代謝紊亂作用機制

3.1 AMPK介導T2DM OB分化

OB是主導骨形成細胞，由骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells, BMSCs)分化產生。研究發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)/BMPs、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等關鍵途徑可直/間接作用于Runx2、Osterix等靶基因，調控OB分化[17]。而生長分化因子-11(growth differentiation factor 11，GDF11)、Orai1、micro RNAs(如miR-764-5p、miR-338-3p、等)等關鍵分子亦起重要作用[18]。OB分化及骨形成紊亂造成骨代謝失調。T2DM大鼠BMSCs分化產生的OB數(shù)量和骨形成能力被抑制，使得骨形成下降[19]。在研究PPARγ抑制劑對T2DM小鼠脂肪細胞分化影響時，發(fā)現(xiàn)脂肪細胞分化增多的同時，OB數(shù)量減少且成骨能力下降[20]。對T2DM小鼠分化產生的OB進行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色，發(fā)現(xiàn)OB數(shù)量和骨形成能力顯著下降[21]。綜上表明，T2DM骨質疏松發(fā)生與OB數(shù)量和骨形成能力下降密切相關。自發(fā)性T2DM小鼠(KK-Ay小鼠)OB合成Col1等有機質減少，造成鈣、磷等沉積障礙，使得BMD下降及骨組織形態(tài)結構退化[12]。并且，T2DM OB自噬和凋亡增加，亦會負向調控OB分化及骨形成[22]。

T2DM抑制OB分化過程受眾多信號途徑或分子調控。AMPK磷酸化后將開啟一系列復雜信號途徑，加快ATP合成并減少ADP消耗。并且，其作為應答代謝壓力的傳感器，當乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)等底物被抑制后，可抑制脂肪酸和膽固醇合成途徑(即分解ATP的能量消耗途徑)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK通過胰島素途徑調控T2DM發(fā)生，當胰島素信號途徑被抑制(如IR)時，其可作為備用途徑參與糖脂代謝，改善IR[24]。另外，AMPK α1亞基敲除小鼠出現(xiàn)高血糖、高血脂且骨組織病理表征與T2DM小鼠表型相似。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1-/-小鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，骨組織表征與T2DM的病理特征更一致。提示，AMPKα1基因缺失是T2DM發(fā)病及骨質疏松癥發(fā)生的主因。

T2DM骨質疏松癥與OB分化減少及骨形成能力下降息息相關[25]，但其分子調控機制尚不清晰。AMPK是一多底物Ser/Thr蛋白激酶，近來證實，其在T2DM發(fā)病過程中扮演關鍵調控作用。將其敲除后，eNOS-NO途徑下調BMP-2及下游Runx2表達，抑制T2DM大鼠OB分化及骨形成能力[26]。Meier等[27]在綜述T2DM對骨影響時，發(fā)現(xiàn)T2DM骨質疏松甚至骨折發(fā)生與AMPK/USF-1/SHP途徑被抑制后下調Runx2、Dlx5和Osterix等表達，進而抑制OB分化及骨形成密切相關。當利用DN-AMPK(AMPK抑制劑)抑制MC3T3-E1中AMPK磷酸化后，通過孤兒核受體SHP調控Runx2反式激活，降低OB骨形成及標志基因：ALP、骨鈣素(osteocalcin，OCN)等表達[28]。T2DM大鼠骨中AMPK失活后，骨形成特異性基因：ALP、OCN、Runx2/Cbfa1 等表達下調會抑制OB分化；體外研究發(fā)現(xiàn)，激活AMPK可上調骨形成基因ALP、OCN、Runx2/Cbfa1 等表達，促進OB分化及活性[29]。

3.2 AMPK介導T2DM OC分化

作為主導骨吸收的OC，其分化及骨吸收能力增強是T2DM骨質疏松發(fā)生另一主因，但有關T2DM促進OC分化的相關研究尚存爭議。Kitamura等[30]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM金魚骨量下降與骨基質中膠原纖維的非酶糖基化下降相關，而其TRAP活性變化不顯著。但有研究卻發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠礦化染色呈骨質疏松表征，且骨中OC活性(即TRAP活性)增強[31]。脛骨硬組織切片TRAP染色后多核OC數(shù)量增多，其松、皮質骨：BV/TV、Tb.N、Tb.Th等指標顯著下降[32]。這與T2DM小鼠異位骨化障礙導致的OC數(shù)量增多及骨吸收功能增強密切相關[33]。上述研究結果差異，可能與研究所用動物模型及所檢測組織的形成機制及組分存在較大差異有關。但后續(xù)研究證實，T2DM OC分化增加導致骨質疏松發(fā)生。

AMPK是介導T2DM骨質疏松發(fā)生的能量代謝調節(jié)器，但有關其調控OC分化及骨吸收的研究較少。OC分化及其骨吸收是高耗能過程，AMPK ser172位點磷酸化后抑制去卵巢小鼠OC分化、融核[34]。并且，AMPK作為RANKL負調節(jié)劑，激活后抑制其表達，進而激活RANK及下游C-fos-NFATc1途徑，上調關鍵靶基因Oscar、CTSK、Atp6v0d2等表達促進OC分化及其骨吸收能力，導致骨質疏松發(fā)生。T2DM抑制骨中AMPK表達，并且AMPKα1-/-小鼠表型與T2DM小鼠表型高度一致，說明其α1亞基敲除是T2DM發(fā)病的關鍵因素。KK/UpjAy/J (KKAy) 小鼠分化產生OC及多核OC數(shù)量增多，TRAP活性增強[35]。表明，T2DM骨代謝紊亂發(fā)生與OC分化增多且骨吸收增強有關。因此，AMPK調控T2DM促OC分化及骨吸收能力，其分子機制與RANKL誘導的C-fos-NFATc1途徑有關。

4 AMPK在運動改善T2DM骨代謝紊亂中的作用機制

運動是改善骨代謝的重要手段，不同運動對骨產生的力學刺激在促OB分化和骨形成及抑制OC分化和骨吸收的作用效果不同(直接作用力優(yōu)于間接作用力)[36]。T2DM抑制OB分化及骨形成，但有關運動影響此過程的相關研究較少。人體研究中，T2DM患者肥胖導致的體重增加雖對骨產生力學刺激，但OB凋亡增加、骨形成能力下降，松質骨和皮質骨骨組織形態(tài)結構退化[37]。而動物研究發(fā)現(xiàn)，下坡跑產生的直接力學刺激可通過激活T2DM小鼠骨中TGF-β/BMPs途徑，使得BMSCs分化產生的OB數(shù)量增多、骨形成能力增強[38]。體外研究中，流體剪切力促進T2DM小鼠體外培養(yǎng)的OB骨形成能力[39]。分析以上結果，體重對機體產生的直接力學刺激強度較小，而下坡跑和流體剪切力對T2DM骨或OB產生的直接力學刺激較大(包含體重對骨的力學刺激)，促OB分化及骨形成能力作用更大。運動調控T2DM OB分化及骨形成的分子機制尚不完善，僅證實了TGF-β/BMPs途徑。AMPKα1調控T2DM發(fā)病，敲除該基因后小鼠表型與T2DM小鼠表型高度一致。并且，下調AMPK表達抑制T2DM的OB分化及骨形成[40]。AMPK表達下調，通過eNOS-NO途徑抑制BMP-2及下游Runx2，抑制T2DM大鼠OB分化及骨形成能力[26]。體外研究亦證實，激活AMPK后上調骨形成標志基因ALP、OC、Runx2/Cbfa1 等，促進OB分化及其活性[41]。既然運動可顯著改善骨中AMPK表達及T2DM的OB分化和骨形成，并且AMPK介導T2DM抑制OB分化及骨形成過程。那么要問，AMPK是否介導運動改善T2DM OB分化及骨形成？ Kanazawa[42]研究發(fā)現(xiàn)，運動激活T2DM小鼠骨中AMPK，并促進OB分化及骨形成，改善骨量和骨組織形態(tài)結構。因目前相關研究較少，其分子機制尚不清晰。敲除AMPK后，T2DM小鼠骨中eNOS和BMP-2表達及OB分化被抑制[43]。然而，運動可通過激活eNOS和BMP-2改善T2DM小鼠骨質疏松[44]。eNOS和BMP-2作為調控骨形成兩關鍵分子，eNOS可通過PI3K/AKT/ eNOS途徑調控BMSCs向OB分化；而BMP-2作為BMPs重要亞型，可通過Smad途徑調控OB分化。綜上，運動可通過激活AMPKα1表達，促進T2DM OB分化及骨形成能力，改善骨形成代謝。其機制與AMPK介導的Wnt/β-catenin、Runx2等密切相關。并且，骨形成代謝受TGF-β/Smad、Hedgehog、Notch等眾多途徑調控，那么，運動是否可通過以上信號途徑來影響T2DM OB分化及骨形成？

T2DM骨質疏松癥發(fā)生與分化產生的OC和多核OC數(shù)量增多，骨吸收能力增強，導致骨組織微細結構退化密切相關。運動作為改善T2DM骨質疏松的重要手段，其不僅可上調T2DM小鼠骨中AMPK表達并可通過調控C-fos/NFATc1、RANKL/RANK/OPG、PI3K/AKT、ERK等途徑抑制T2DM OC分化及骨吸收[44]。敲除AMPK后，C-fos/NFATc1途徑被抑制，T2DM的OC分化及骨吸收增強。AMPK亦可通過RANKL/RANK/OPG分子軸、PGC-1β、PI3K/AKT和ERK等進行調控[45]。那么，既然AMPK介導T2DM發(fā)生，又介導其OC分化、融核及骨吸收。不禁要問，AMPK是否介導運動抑制T2DM OC分化及骨吸收？研究發(fā)現(xiàn)，游泳可顯著提高T2DM大鼠骨骼肌AMPK表達。但是，運動介導T2DM骨中AMPK表達，調控OC分化及骨吸收能力的研究較少。綜合國內外相關研究，發(fā)現(xiàn)：①T2DM促進OC分化及骨吸收；②AMPK敲除促進T2DM OC分化及骨吸收；③運動(尤其是直接作用力)抑制T2DM OC分化及骨吸收。因此，運動抑制T2DM OC分化及骨吸收的分子機制，與AMPK活化后，抑制C-fos/NFATc1、RANKL/RANK/OPG、PI3K/AKT等信號途徑有關。

5 總結與展望

AMPK是調控能量代謝關鍵分子，亦是T2DM發(fā)生基礎，其激酶上的活性/調節(jié)功能域被ATP/AMP激活后，可調控OB和/或OC分化及功能發(fā)揮。通過對已有相關文獻分析，發(fā)現(xiàn)運動激活AMPK后促進T2DM OB分化及骨形成，并抑制OC分化及骨吸收，改善骨質疏松。因目前研究較少，仍存在較多盲點：AMPK有7種亞型，每種亞型的作用及機制尚待深入研究；AMPK調控T2DM骨質疏松癥的研究較多，但其分子調控網絡尚不完善；不同方式運動是否均能激活T2DM骨中AMPK表達，進而調控骨代謝？哪種方式運動效果更佳？除eNOS-NO、Wnt/β-catenin等途徑，是否還存在其他途徑在AMPKα介導T2DM OB分化及骨形成的運動適應中發(fā)揮作用？運動激活AMPKα后，除作用于RANKL/RANK/OPG分子軸外，是否還存在其他途徑發(fā)揮作用？目前AMPK介導運動影響T2DM骨質疏松癥的分子調控網絡尚待描繪。等等。相信，隨著以上問題的解決將有助于我們深入了解T2DM骨質疏松發(fā)生的分子調控網絡。并且還可讓我們熟知運動狀態(tài)下，AMPK調控T2DM OB分化及骨形成及OC分化及骨吸收的具體機制或網絡，為以后運動改善T2DM骨質疏松癥提供理論依據。