甲狀腺癌RNA分子研究進(jìn)展

林琳，劉建華，吳麗娜

0 引言

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，甲狀腺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)持續(xù)增長。Siegel等[1]對美國近幾年甲狀腺癌的發(fā)病率、死亡率進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌女性患者多于男性，女性甲狀腺癌發(fā)病率已位列惡性腫瘤的第五位，僅次于乳腺癌、肺癌、直腸癌和宮頸癌。甲狀腺癌可分為：來源于濾泡旁細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌和來源于濾泡細(xì)胞的甲狀腺癌。根據(jù)分化程度的不同，又將其分為分化型甲狀腺癌和未分化型甲狀腺癌。分化型甲狀腺癌主要包括甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer,PTC）與甲狀腺濾泡性癌（follicular thyroid cancer,FTC）。其中，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率較高，占甲狀腺癌的80%～85%[2]。甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，多數(shù)研究者在基因水平對甲狀腺癌進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)RET、BRAF[3]等基因在甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。盡管，已有研究證實，信使RNA（messenger RNA,mRNA）、微小RNA（microRNA,miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）與環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）對細(xì)胞生物學(xué)行為以及基因表達(dá)調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用，但是，迄今為止，甲狀腺癌相關(guān)RNA分子在甲狀腺癌的研究中仍較少，且其在甲狀腺癌發(fā)生機(jī)制中的具體作用尚不明確。本文擬對甲狀腺癌相關(guān)RNA的研究進(jìn)展作一綜述。

1 腫瘤相關(guān)RNA的概述

RNA是存在生物細(xì)胞的遺傳信息載體，對細(xì)胞生物學(xué)行為具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。其中，mRNA主要參與正常細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，mRNA翻譯、甲基化修飾失調(diào)[4-5]以及mRNA與miRNA相互作用失衡都有助于腫瘤的發(fā)生。近兩年來許多研究人員對多種非編碼RNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。已有研究證實：lncRNA可通過改變?nèi)旧|(zhì)修飾水平，調(diào)節(jié)mRNA的加工并調(diào)控蛋白活性[6]，從而影響腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。另外，有研究者表明mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）相互作用，形成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程起一定的作用[7]。lncRNA與circRNA可作為ceRNA分子，具有miRNA海綿的功能，通過競爭性結(jié)合miRNA上的RNA結(jié)合蛋白位點，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，在腫瘤發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用[8]。因此，各類RNA在腫瘤發(fā)生、增殖和侵襲轉(zhuǎn)移等過程中起重要調(diào)控作用。

2 甲狀腺癌相關(guān)RNA

隨著甲狀腺癌發(fā)病率的增長，研究者們對mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA在甲狀腺癌發(fā)生中的作用機(jī)制進(jìn)行深入探索，為甲狀腺癌的診斷和治療提供了新思路。

2.1 mRNA

mRNA是攜帶遺傳信息的一類單鏈核糖核苷酸，參與生物的轉(zhuǎn)錄與蛋白翻譯過程，而腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長、繁殖能力，腫瘤發(fā)展過程需要更多的蛋白質(zhì)支持。mTOR是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中mTOR的過度激活導(dǎo)致mRNA翻譯失調(diào)，使機(jī)體蛋白質(zhì)合成速率增加，從而促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[5]。此外，Pinello等[4]通過研究證實：mRNA甲基化修飾的失調(diào)有助于腫瘤的發(fā)生，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修飾的mRNA水平檢測可能是一種新型生物分子標(biāo)志物檢測技術(shù)，對甲狀腺癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療具有重要的臨床意義。因此，對臨床活檢標(biāo)本中mRNA異常表達(dá)的檢測，有助于患者的早期診斷、預(yù)測腫瘤預(yù)后并提供適宜的治療方法。其中，BRAF mRNA是研究較多的mRNA，在PTC發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

BRAF突變是PTC中最常見的基因改變，在40%～45%的PTC中可發(fā)生BRAF突變，其中99.7%是BRAFV600E突變[9]。BRAF mRNA表達(dá)水平的異常改變與甲狀腺癌的發(fā)生存在一定的聯(lián)系。Marranci等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是BRAF基因表達(dá)的調(diào)控因子，miRNA介導(dǎo)BRAF基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。其中mir-125b-1-3p、mir-181b-5p、mir-3180、mir-3180-3p和mir-3651是BRAF靶基因表達(dá)的陽性調(diào)節(jié)因子，可增加BRAF mRNA及其內(nèi)源性BRAF蛋白質(zhì)的表達(dá)。有研究者[11]在癌癥基因組圖譜中選擇了353例PTC，包括193例BRAFV600E突變型PTC和160例BRAF野生型PTC。運用RNASeq和期望最大化算法測量mRNA豐度。經(jīng)過統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E突變型PTC患者中BRAF mRNA水平明顯高于野生型BRAF的PTC患者。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BRAF mRNA的高水平表達(dá)與PTC的侵襲性有關(guān)，BRAF mRNA表達(dá)水平的檢測有助于對PTC預(yù)后危險分層的評估。Araujo等[12]采用實時定量PCR和PCR-RFLP檢測BRAF mRNA表達(dá)水平，以確定BRAFV600E基因突變。結(jié)果表明，BRAF mRNA表達(dá)的差異，有助于確定BRAFV600E突變的存在來區(qū)分甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺腫物。因此，BRAF mRNA表達(dá)水平的檢測有利于鑒別甲狀腺乳頭狀癌，評估甲狀腺癌侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期，有助于甲狀腺癌的臨床診斷與治療。

此外，Choi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中維生素D受體基因（vitamin D receptor gene,VDR）表達(dá)高于正常組織，VDR表達(dá)與BRAFV600E突變和復(fù)發(fā)之間也存在著相關(guān)性。維生素D3的活性形式1，25-二羥基維生素D3通過結(jié)合VDR發(fā)揮抗腫瘤活性，維生素D受體可能是治療甲狀腺癌的潛在靶點。還有研究表明[14]在大多數(shù)PTC組織中von Hippel-Lindau（VHL）腫瘤抑制基因的表達(dá)降低，VHL的低表達(dá)與甲狀腺癌外擴(kuò)散和包膜侵犯顯著相關(guān)。甲狀腺相關(guān)mRNA可作為PTC患者潛在的診斷生物標(biāo)志物和預(yù)后預(yù)測因子。隨著甲狀腺癌發(fā)病率的上升，迫切需要我們研究更多新型的甲狀腺相關(guān)mRNA從而改善甲狀腺癌的早期診斷和治療。

2.2 miRNA

miRNA[15]是一組長度為18～22 nt的短鏈非編碼RNA。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，miRNAs可以通過與靶向RNA轉(zhuǎn)錄物的3個非翻譯區(qū)（3’-UTRs）上的miRNA反應(yīng)元件（MREs）不完全結(jié)合來抑制其靶基因，并通過降解mRNA或抑制翻譯過程來降低靶蛋白的表達(dá)。miRNA是癌基因和抑癌基因轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控的關(guān)鍵分子，在轉(zhuǎn)錄后過程中也起到重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA的異常表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、增殖和凋亡等。據(jù)相關(guān)研究[16]報道，miRNA-221/222可作為區(qū)分甲狀腺結(jié)節(jié)有效的生物標(biāo)志物，但miRNA在甲狀腺癌中的作用機(jī)制仍然需要科研工作者進(jìn)一步探索。

miRNA被認(rèn)為是甲狀腺癌最具潛能的新型生物學(xué)標(biāo)志物之一。它們通過負(fù)向調(diào)節(jié)其靶向mRNA穩(wěn)定性或翻譯過程，或靶向作用于相關(guān)蛋白受體，而在細(xì)胞增殖、凋亡和生長等細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。研究者[17]通過實時定量PCR對109例PTC組織和配對的鄰近正常甲狀腺組織miR-299的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PTC組織中miR-299-5p的表達(dá)明顯低于配對的癌旁正常甲狀腺組織。進(jìn)一步利用細(xì)胞遷移、侵襲實驗與熒光素酶報告基因檢測等方法研究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，而miR-299-5p的過表達(dá)則抑制甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體（estrogen receptor,ER）在PTC組織中明顯增高miR-299-5p通過靶向作用于ER，從而調(diào)節(jié)甲狀腺癌的進(jìn)展。ER的過表達(dá)能夠削弱miR-299-5p對甲狀腺癌細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)甲狀腺癌的發(fā)生。miR-299-5p參與甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲，miR-299-5p可能成為甲狀腺癌治療的靶基因。因此，深入研究甲狀腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，對實現(xiàn)有效的個體化治療具有重要意義。

Zheng等[18]通過實時定量PCR對165例PTC患者血清樣本中miR-203的表達(dá)進(jìn)行評估。分析結(jié)果顯示，與無復(fù)發(fā)的PTC患者相比，腫瘤復(fù)發(fā)的PTC患者血清中miR-203表達(dá)顯著升高。提示血清miR-203表達(dá)可作為預(yù)測PTC復(fù)發(fā)和預(yù)后的非侵入性腫瘤分子標(biāo)志物。從臨床實踐意義分析，血清miR-203檢測方法能夠減少對患者的創(chuàng)傷，檢測起來更加方便，有利于對甲狀腺癌患者的篩查，讓患者得到更好的治療。

2.3 lncRNA

lncRNA[19]可存在于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，是一類超過200個核苷酸長度無編碼能力的轉(zhuǎn)錄物。在過去，lncRNA轉(zhuǎn)錄本一直被認(rèn)為是一類轉(zhuǎn)錄噪聲。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核內(nèi)的lncRNA可介導(dǎo)染色體基因調(diào)節(jié)復(fù)合物進(jìn)入特定的基因組位點，并通過染色體修飾來調(diào)控基因的表達(dá)。細(xì)胞核lncRNA可參與mRNA與miRNA的加工。另外，能夠與其轉(zhuǎn)錄因子形成特定的復(fù)合物，從而影響基因的表達(dá)。而胞質(zhì)中的lncRNA則參與mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)，并具有miRNA海綿的功能，從而調(diào)控基因的表達(dá)。lncRNA可作為轉(zhuǎn)錄、mRNA加工以及轉(zhuǎn)錄后等生物學(xué)過程中重要的調(diào)節(jié)因子。還有研究表明，lncRNA[6]還可作為信號分子，存在于外泌體中，調(diào)節(jié)細(xì)胞間信息傳遞。lncRNA也是腫瘤發(fā)病機(jī)制中重要調(diào)節(jié)物，參與腫瘤細(xì)胞的凋亡、侵襲和遷移。近年來，多個研究表明，lncRNA通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)或抑制膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展。組織細(xì)胞中相關(guān)lncRNA基因的檢測，可能成為癌癥診斷和預(yù)后重要標(biāo)志物。lncRNA的表達(dá)在甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其中常見的與甲狀腺癌相關(guān)的lncRNA包括：生長停滯特異性基因5（growth arrest-specific5,GAS5）、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）以及甲狀腺乳頭狀癌易感候選基因3（Papillary thyroid carcinoma susceptibility candidate 3,PTCSC3）。

GAS5是一種長度為650個堿基的lncRNA，在生長停滯期間高水平表達(dá)。這種lncRNA最初是在1998年利用減法雜交從NIH3T3細(xì)胞系中分離出來的。到目前為止，已經(jīng)檢測到至少4個GAS5的剪接變異體[20]。多個研究表明，GAS5 lncRNA影響腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，在直腸癌、膀胱癌、乳腺癌等癌癥中表達(dá)失調(diào)，并證實了該分子在腫瘤中的抑制作用。Guo等[21]應(yīng)用定量實時聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測甲狀腺癌和良性腫瘤組織中l(wèi)ncRNA GAS5的表達(dá)水平，甲狀腺癌組織中的lncRNA GAS5表達(dá)較良性甲狀腺腫瘤組織顯著降低。另外，lncRNA GAS5的表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的多發(fā)癌灶密切有關(guān)。但GAS5 lncRNA在甲狀腺癌中的表達(dá)水平及作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

MALAT1又稱為核富集豐富轉(zhuǎn)錄子2（nuclearenriched abundant transcript 2,NEAT2），是位于染色體11q13上的長鏈非編碼RNA[22]。Ji等[23]最初在早期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中發(fā)現(xiàn)MALAT1，并被確定為NSCLC的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物。大量研究表明，MALAT1表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)乳腺癌、肝癌等癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。也有研究表明[24]，MALAT1在PTC組織中的表達(dá)水平顯著增加，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和WHO分期相關(guān)聯(lián)。MALAT1是PTC的潛在診斷標(biāo)志物，對MALAT1在甲狀腺中作用機(jī)制的研究有助于探討甲狀腺癌的新型診斷與治療手段。

甲狀腺乳頭狀癌易感候選基因3（papillary thyroid carcinoma susceptibility candidate 3,PTCSC3）最初是由Jendrze在甲狀腺中發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA之一[25]。Wang等[15]通過實時定量PCR和蛋白印跡技術(shù)檢測基因以及熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測等，研究發(fā)現(xiàn)PTCSC3/miR-574-5p通過SCAI調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin的活性，介導(dǎo)PTC細(xì)胞的增殖和遷移，并通過體內(nèi)實驗驗證了過表達(dá)PTCSC3抑制腫瘤的生長。多個研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在甲狀腺癌中起重要的調(diào)控作用。對甲狀腺癌相關(guān)lncRNA的研究，有利于新型標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，能夠有效地減少過度診斷和治療，為甲狀腺癌的分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。

2.4 circRNA

circRNA[26]代表了一類新的內(nèi)源性非編碼RNA，它沒有5′或3′末端，而是由共價鍵相互連接形成一個封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由于沒有可以接近的末端，circRNA對核酸外切酶具有抗性，這使得circRNA比線性RNA亞型更穩(wěn)定。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以競爭性結(jié)合miRNA上的RNA結(jié)合蛋白位點，來影響由競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的特定基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。

Cai等[27]用RT-PCR檢測了PTC組織和PTC細(xì)胞系中circBACH2（hsa_circ_0001627）的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)circBACH2在PTC組織和PTC細(xì)胞系中高度表達(dá)。采用FISH技術(shù)、熒光素酶報告法和ago2-rip法證實了circBACH2可以直接與mir-139-5p結(jié)合，并減輕LIM-only4（LMO4）對靶細(xì)胞的抑制作用，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。該項研究表明circ-BACH2是一種新型致癌RNA，可以海綿化miR-139-5p，并可作為PTC的腫瘤生物標(biāo)志物，也為制定PTC的臨床治療策略提供新的有力依據(jù)。

另外，研究者[28]通過PCR技術(shù)在PTC組織和PTC細(xì)胞系中測circRNA_102171的表達(dá)，并利用克隆技術(shù)以及細(xì)胞遷移侵襲實驗技術(shù)，對circRNA_102171在甲狀腺癌中的作用機(jī)制進(jìn)一步研究。結(jié)果表明：circRNA_102171在腫瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。circRNA_102171沉默會抑制PTC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其過表達(dá)通過CTNNBIP1依賴的方式激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)PTC進(jìn)展。越來越多的研究表明，circRNA在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，這些特征使circRNA成為多種疾病的潛在分子生物標(biāo)志物。

3 ceRNA

最近兩年研究者發(fā)現(xiàn)mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA相互作用，形成ceRNA通信調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。ceRNA是一種RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它可以通過降低靶向miRNA的濃度，使具有共同miRNA應(yīng)答元件（MREs）的其他信使RNA（mRNAs）去阻遏而相互通信[7]。

lncRNA與circRNA可以作為miRNA海綿，與miRNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)miRNA的功能，并在調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。lncRNA、circRNA二者分別與相關(guān)的miRNA、mRNA形成lncRNA-miRNA-mRNA與circRNAmiRNA-mRNA兩種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。有研究表明，lncRNA、circRNA存在相應(yīng)的miRNAs反應(yīng)元件（MRES），能夠作為ceRNA，內(nèi)源性競爭結(jié)合miRNA位點，從而影響miRNA的活性，進(jìn)而影響靶mRNA的翻譯水平[8,29]。Liu等[30]通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，circEIF6在PTC中高度表達(dá)，而miR-144-3p在PTC細(xì)胞中的表達(dá)低于癌旁組織。利用質(zhì)粒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灥葯z測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，circEIF6通過靶向miR-144-3p調(diào)節(jié)TGF-β，從而影響甲狀腺癌對順鉑治療的耐藥性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circEIF6可通過激活腫瘤細(xì)胞的自噬作用來增強(qiáng)順鉑耐藥性。當(dāng)circEIF6被抑制時，miR-144-3p的表達(dá)增加，順鉑耐藥性減弱，體內(nèi)和體外的TGF也下降。深入探討各種RNA在甲狀腺癌中的作用，為甲狀腺癌靶向治療方式提供新視野。近年的研究揭示ceRNA在甲狀腺癌中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，而ceRNA中各種類型的RNA在甲狀腺癌的具體發(fā)病機(jī)制仍然需要我們做更深入的研究。

4 展望

甲狀腺癌的發(fā)病率逐年增長，盡管大部分患者可進(jìn)行手術(shù)治療，預(yù)后較好，但仍存在過度診斷和治療情況。甲狀腺癌的診斷主要基于組織病理學(xué)，但組織病理學(xué)報告在術(shù)后才能獲得，這種情況下，與某些組織病理學(xué)特征相關(guān)的遺傳生物標(biāo)志物的術(shù)前使用可能有助于臨床醫(yī)生制定最適合的治療方案。甲狀腺癌中差異性表達(dá)的不同類型RNA都有望成為新型甲狀腺腫瘤分子標(biāo)志物潛能，對預(yù)測甲狀腺癌的預(yù)后等方面有重要的臨床意義。此外，在血循環(huán)中檢測甲狀腺相關(guān)RNA能夠減少對患者的創(chuàng)傷，并且更加方便快捷，為進(jìn)一步研究甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展的生物分子機(jī)制提供新思路，對于診斷、預(yù)測甲狀腺癌有廣闊的應(yīng)用前景。