腸道菌群與免疫檢查點抑制劑研究進展

但慧敏，周永寧，關泉林

0 引言

腸道菌群與人類多種疾病的發(fā)生關系密切，因而受到廣泛關注[1]。寄生在胃腸道的共生微生物與人體健康密切相關[2-3]。如腸道菌群通過阻止病原體的生長，產生有益的微生物，促進營養(yǎng)物質代謝和人體健康[4]。目前，已認識到它們通過代謝、免疫調節(jié)等多種功能維持宿主的健康和生理活動[5]。腸道微生物群還可影響局部和全身炎性反應，但尚不清楚共生菌是如何影響無菌腫瘤微環(huán)境中的炎性反應[6]。

有研究表明腸道菌群具有抗癌的積極作用，它們通過增強宿主抗腫瘤免疫反應抵抗腸道以外的惡性腫瘤[7]。有研究顯示腸道菌群能提高免疫檢查點抑制劑反應性，如嗜黏蛋白-艾克曼菌具有調節(jié)腫瘤細胞和免疫細胞雙重活性，進而提高免疫檢查點抑制劑的療效[8]。這些研究為識別可能具有抗癌作用的微生物奠定了理論基礎。

1 腸道菌群與腫瘤的關系

人體腸道中約有3.8×1013個細菌，重量接近1.8千克，統(tǒng)稱腸道微生物組。腸道中的細菌基因組被譽為影響人類健康的“第二基因組”[9]。腸道菌群與宿主精神行為、營養(yǎng)、免疫、發(fā)育等方面的關系十分密切。近年來，癌癥和腸道菌群之間的聯(lián)系已得到研究證實[10-11]，正常的腸道菌群對腫瘤的影響具有多樣性。腸道菌群在一定的條件下可促進腫瘤的發(fā)生，如產生有毒代謝物或致癌產物作為直接促癌因素，間接促癌因素包括引發(fā)炎性反應或免疫抑制；另一方面，腸道正常菌群又可以抑制腫瘤的發(fā)生，大量研究發(fā)現(xiàn)細菌感染與腫瘤消退有關聯(lián)性，證明細菌具有潛在的治療癌癥的作用。

Mastromarino等[12]在1978年的研究中發(fā)現(xiàn)了直腸腫瘤患者優(yōu)桿菌屬與梭狀桿菌屬數(shù)目比健康人群多，而厭氧菌和需氧菌數(shù)量與健康人群無明顯差別，提示某些腸道細菌有促瘤作用。Mizutani等[13]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、糞球菌和副腐化梭狀芽胞桿菌聯(lián)合應用能促進肝臟腫瘤的發(fā)生，嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌能負調節(jié)上述細菌的促瘤作用。Ponzetto等的一項研究顯示[14]，幽門螺桿菌空泡毒素（V acrolating Cytotoxin,VacA）特異性血清陽性與結直腸癌發(fā)病率增加11%相關，證明幽門螺桿菌感染可能與結直腸癌的風險增加有關，提示幽門螺桿菌感染可能在結直腸癌發(fā)展中具有病理生理作用。細菌感染引起的慢性炎性反應介質，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1,IL-1），促使核轉錄因子κB（nuclear transcription factor κB,NF-κB）產生，引起細胞增殖，抑制細胞凋亡，證明炎性反應在引起腫瘤發(fā)生的過程中起到一定的作用。

2 腸道細菌對腫瘤細胞和免疫細胞的影響

微生物群在恢復免疫檢查點抑制劑應答方面的活性可能與其促進腫瘤細胞凋亡和增加免疫細胞活性有關，從而為識別應答的新生標志物開辟了道路。細菌增強機體免疫系統(tǒng)抗腫瘤反應屬于細菌固有的抗腫瘤作用，細菌釋放的毒素具有高度免疫原性可提高免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別。

2.1 腸道細菌抑制腫瘤細胞增殖及促進凋亡

嗜黏蛋白-艾克曼菌（Akkermansia muciniphila,A.muciniphila）是由荷蘭瓦赫寧根大學的研究人員首次從人糞便中分離的一種腸道細菌，屬疣微菌門[15]。A.muciniphila能降解胃腸道中的黏蛋白[16]，并對膳食中的多糖水解和發(fā)酵，產生以乙酸和丙酸為主的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFAs），從而調控細胞脂代謝與生長過程中的多種轉錄因子和基因表達[17]。短鏈脂肪酸（SCFAs）作為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled receptors,GPCRs）GPR41和GPR43的配體，對癌細胞和免疫細胞具有雙重活性，以此促進抗PD-1藥物療效的發(fā)揮[8]。GPR43可以通過調控短鏈脂肪酸誘導的癌細胞凋亡發(fā)揮抑癌活性。丙酸通過抑制組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）誘導組蛋白高乙酰化，促進染色質松弛，增加DNA與轉錄因子的活性，激活細胞周期抑制因子p21，導致G1期阻滯和癌細胞凋亡[18]。同時下調凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族中數(shù)個成員的表達以及上調起始凋亡蛋白酶6、7、8和執(zhí)行凋亡蛋白3的基因表達來維持腫瘤免疫治療，如提高抗程序性細胞死亡蛋白1抗體（programmed cell death 1,PD-1）治療療效[19]。

乳酸桿菌具有抵御有害微生物侵襲和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等作用[20]。Hwang等[21]研究發(fā)現(xiàn)將乳酸桿菌和胃癌KATO3細胞共同孵育48 h后，胃癌KATO3細胞生長受到顯著抑制，并誘導大部分KATO3細胞凋亡。Tiptirikourpeti等[22]在鼠結腸癌CT26細胞和人結腸癌HT29細胞中添加干酪乳桿菌ATCC393（lactobacillus casei ATCC393），發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌ATCC393濃度越大，結腸癌細胞增殖抑制作用越明顯，與干酪乳桿菌 ATCC393共同孵育24 h的結腸癌細胞活力明顯下降。雙歧桿菌屬革蘭陽性無芽孢厭氧菌，對維持機體健康具有重要作用[23]。攝入含有乳酸桿菌和雙歧桿菌的益生菌后腫瘤細胞凋亡的增加可由SCFA引起，尤其是丁酸，能抑制癌細胞的增殖并引發(fā)其分化[24]。而Sivan等[25]的實驗研究顯示，單獨口服雙歧桿菌可以控制腫瘤的生長趨勢，與使用抗PD-L1特異性抗體療效相當，且兩者合用幾乎可以控制腫瘤的擴散。研究表明乳酸桿菌及雙歧桿菌均能誘導一氧化氮（NO）的合成[26-27]，且NO具有修復細胞DNA、通過誘導細胞毒性反應促進腫瘤細胞凋亡等抗腫瘤作用[28-29]。

2.2 腸道細菌增強抗腫瘤免疫反應

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）與信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3,STAT3）是細胞內重要的轉錄因子[30-31]。嗜黏蛋白-艾克曼菌產生的SCFAs抑制小鼠結腸調節(jié)性T細胞中HDAC的表達，特別是HDAC6和HDAC9的表達，可激活mTOR-S6K和STAT3通路。mTOR-S6K和STAT3通路的激活能促進CD4+T 淋巴細胞和CD8+細胞毒性T淋巴細胞生成。CD4+T淋巴細胞增加Th17、Th1、FoxP3+Treg、IL-10+Treg分泌[32]，其中Th1細胞可以促進INF-γ、TNF-β、IL-2生成；Th17能促進IL-17、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-26分泌；IL-17刺激γδT細胞生成能增強抗腫瘤免疫力，SCFAs在Tc1和Tc17細胞條件下高度誘導CD8+T細胞中IL-10、IFN-γ和IL-17的表達，這些細胞因子都具有促進免疫細胞抗腫瘤應答功能[11]，且嗜黏蛋白-艾克曼菌產生的丙酸能增加血管內皮細胞中細胞間黏附分子（vascular cell adhesion molecule,ICAM-1）和E-選擇素的表達，從而促進T細胞遷移，有利于形成抗腫瘤免疫微環(huán)境[33]。

大量的研究證明乳酸桿菌及雙歧桿菌均能刺激免疫細胞參與抗腫瘤反應，并促進細胞因子分泌?？诜﨨S8乳酸桿菌的腫瘤模型小鼠可明顯觀察到腫瘤體積縮小，腫瘤細胞增殖程度下降，NS8乳酸桿菌能顯著抑制NF-κB的活化并上調細胞因子IL-10，體現(xiàn)了其對癌細胞的抑制作用[34]。有資料顯示，乳酸桿菌的細胞壁肽聚糖（whole peptidoglycan,WPG）能夠提高巨噬細胞的吞噬率及吞噬指數(shù)，還能夠刺激巨噬細胞產生的IL-12、TNF-α等細胞因子的分泌，從而增強對腫瘤細胞的殺傷活性。有研究[35]探索了雙歧桿菌對免疫反應的調節(jié)作用，證明了雙歧桿菌對T細胞介導的免疫反應有輔助增強作用，服用雙歧桿菌的肝癌模型小鼠可改善PD-L1治療反應，且雙歧桿菌及其細胞壁肽聚糖可增加腫瘤壞死因子和白細胞介素-6的產生[36]。此外，雙歧桿菌DNA能激活樹突狀細胞，進而活化T細胞。這些細胞、因子等的大量出現(xiàn)能夠提高機體免疫功能，并能抑制腫瘤細胞的生長，證明了腸道細菌對抗腫瘤免疫反應的促進作用。

3 腸道菌群與免疫抑制劑治療研究現(xiàn)狀

免疫檢查點抑制劑的出現(xiàn)是癌癥免疫治療的一大突破，在研究抗腫瘤免疫反應的調節(jié)時，腸道菌群體現(xiàn)了其重要性，但潛在的分子機制仍然不是很清楚。最近由Sanford Burnham Prebys醫(yī)學研究所研究人員發(fā)起的一項研究[37]，指出了未折疊蛋白反應（unfolded protein response,UPR）是一種維持蛋白質健康（動態(tài)平衡）的細胞信號通路。UPR組分表達降低與治療的反應性相關。接受免疫檢查點抑制劑抗細胞毒淋巴抗原-4（cytotoxic-T-lymphocyteassociated protein 4,CTLA-4）或細胞程序性死亡蛋白-1（programmed cell death 1,PD-1）治療后，小鼠和人類黑色素瘤標本中UPR表達也降低。UPR信號的改變與腸道微生物群組成的改變和控制黑色素瘤生長的抗腫瘤免疫一致。顯示了其可作為潛在的患者分層標志物，研究人員已將UPR確定為腸道微生物群與抗腫瘤免疫之間的一個重要聯(lián)系。

Vétizou等[38]使用抗CTLA-4治療小鼠腫瘤模型，實驗對比了無特定病原體及無菌的小鼠肉瘤模型在使用抗CTLA-4制劑之后，無特定病原體的小鼠對腫瘤具有抑制作用，而無菌小鼠抑制作用不明顯。該研究指出腸道菌群中的類擬桿菌屬如脆弱擬桿菌、洋蔥伯克氏桿菌等的多樣性與其抗腫瘤作用密切相關，且能夠提高白細胞介素12（IL-12）依賴性Th1免疫應答，促進腫瘤組織中樹突狀細胞（dendritic cells,DC）的成熟。IL-12對多種腫瘤包括結腸癌、惡性黑色素細胞瘤、腎細胞癌、肝癌、卵巢癌等的生長和轉移具有強有力的抑制作用[39]。Chaput等[40]發(fā)現(xiàn)在CTLA-4治療的黑色素瘤患者中，糞桿菌等厚壁菌門的腸道微生物群具有更好的臨床反應。可預測富含糞桿菌等厚壁菌門的腸道菌群（A 群）有更好的臨床反應。與富含擬桿菌屬（B 群）的患者相比，A 群患者有更長的無進展生存期（P=0.0039），該研究還指出CD4+T細胞及誘導型T細胞協(xié)同刺激因子（inducible T cell costimulator,ICOS）明顯增加，ICOS被認為是抗CTLA-4治療療效的生物標志物，富含糞桿菌的患者CD4+T細胞及ICOS明顯增加。

Gopalakrishnan等[41]發(fā)現(xiàn)受益于免疫治療的腸道菌群樣本種類豐富且疣微菌科等腸菌較豐富，在治療無反應的小鼠腫瘤微環(huán)境中可以檢測到RORTγ+Th17細胞密度增多，脾臟組織中調節(jié)性CD4+FoxP3+T細胞、CD4+IL-17+細胞的浸潤水平更高；而治療有反應的小鼠瘤組織中（表達CD45+CD11b+Ly6G+）的先天性效應細胞較豐富，且表達CD11b+CD11C+的骨髓抑制細胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）水平較治療無反應小鼠低。轉移性黑色素瘤患者使用抗PD-1單抗治療后有效患者的菌群多樣性顯著高于無效患者，兩組患者的無進展生存期分別為4.1月和3.5月（P=0.007），中位總生存期分別為20.6月和11.5月（P＜0.001）。

Routy等[42]發(fā)現(xiàn)使用抗生素的癌癥患者無進展生存期和總生存期明顯短于未使用抗生素的免疫治療患者，在非小細胞肺癌和腎細胞癌中，與良好臨床結果最顯著相關的共患病菌為A.muciniphila（P=0.004）。研究者認為嗜黏蛋白-艾克曼菌能增強Th1細胞反應活性，使干擾素-γ（INF-γ）釋放水平增加，與良好的臨床結果有關，并且嗜黏蛋白-艾克曼菌還可通過依賴Th1細胞因子誘導樹突狀細胞分泌IL-12，IL-12可促使CCR9+CXCR3+CD4+T淋巴細胞募集增加。IL-12活化細胞毒性淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte,CTL），刺激T細胞、自然殺傷細胞（natural killer,NK）分泌INF-γ、TNF-α，IL-2等多種細胞因子，促進樹突狀細胞和巨噬細胞成熟和活化，將有助于提高抗PD-1免疫治療反應性[43]。

Matson等[44]對一組16例轉移性黑色素瘤患者的研究也顯示，免疫檢查點阻斷治療的反應性存在明顯差異。對抗PD-1治療有反應的患者在基線糞便樣本中有屎腸球菌、長雙歧桿菌、產氣柯林斯菌和乳酸桿菌的富集（P=0.004）。給無菌小鼠移植這些對治療有反應的腸菌，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長速度較慢，免疫治療的療效顯著提高。這些效應是由腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞密度的增加和FoxP3+CD4+調節(jié)性T細胞的減少介導的。

Tanoue等[45]發(fā)現(xiàn)有11株細菌能提高免疫治療效果，且與INFγ+CD8 T細胞水平呈正相關關系。這11株菌株組成了一個細菌“聯(lián)合體”，它們共同誘導炎性細胞而不引起炎性反應，其主要依賴于CD103+樹突狀細胞和主要組織相容（MHC）Ⅰa類分子的介導。這是首次鑒定出的、可以增強免疫檢查點抑制劑效果的人類腸道細菌“聯(lián)合體”。但有研究者提出，細菌移植前需要使用抗生素對患者進行預處理，讓細菌能夠順利地定植，這種處理可能會增加患者艱難梭菌感染的風險。這些都還需要在未來的試驗中進行驗證，找到能夠平衡療效與風險的方法[46]。

癌癥治療失敗的一個關鍵原因是腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，而免疫監(jiān)視通常會識別并消除腫瘤細胞[47]。腫瘤浸潤CD8+T細胞、輔助T1（TH1）細胞、CD4+T細胞和CD103+DCs被廣泛認為是多種抗癌治療反應的核心[48-50]。部分有益菌群能提高腫瘤組織中免疫細胞浸潤，作為腫瘤免疫治療有利生物標志物，為后續(xù)治療及提高腫瘤患者獲益率提供可能。而抗生素的使用可能會影響免疫檢查點抑制劑的療效[51]。了解這些腫瘤細胞內因和外因引起的原發(fā)性、適應性和獲得性免疫耐受機制對于提高腫瘤患者免疫治療反應以及降低免疫相關不良事件的風險具有重要意義。

4 總結與展望

目前，腸道菌群的作用逐漸被人們重視，旨在調節(jié)腸道菌群的策略越來越被認為是改善免疫治療效果的有效工具。腸道菌群一方面通過影響腫瘤細胞生長周期促進其凋亡，另一方面通過增加腫瘤組織中的免疫細胞浸潤并促進細胞因子分泌，進而提高免疫檢查點抑制劑療效。這些有益菌類諸如糞桿菌屬、雙歧桿菌、乳酸桿菌、嗜黏蛋白—艾克曼菌等。我們需要深入的基礎研究來揭示菌株在人體內產生深刻的免疫調節(jié)作用的精確機制，篩選出對腫瘤治療有益的細菌，提高臨床免疫治療藥物獲益程度。