核糖核苷酸還原酶抑制劑治療腫瘤的研究進展

王安鴿，武喆，王莉，裘云慶

0 引言

核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase,RR）存在于所有類型的生物細胞中，催化核糖核苷酸還原成相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸，并且參與代謝核苷酸的過程。RR是DNA復制和修復所必需的一種多亞單位酶，對于控制細胞增殖和維持基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要[1]。幾乎所有的真核生物都含有RR，一些原核生物和噬菌體也表達這種酶，它對于控制細胞的分裂增殖和維持基因組的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用[2]。人類RR的表達和活性增加與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，臨床上已有幾代RR抑制劑被用于治療多種實體瘤和血液惡性腫瘤[3]。

在DNA合成和修復中，RR不僅提供各種前體物脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside triphosphate, dNTPs），而且有調(diào)節(jié)各種dNTPs含量平衡的作用，在細胞增殖中起著關(guān)鍵作用。其活性的降低使細胞內(nèi)dNTPs含量降低，從而抑制DNA的合成和修復，致使細胞周期停滯[4]。研究證實[5]RR活性的增加與惡性腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，RRM2不僅能夠與各種癌基因協(xié)同作用，促進正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化，還能提高癌細胞的侵襲能力。腫瘤細胞對RR抑制劑的敏感度較正常細胞高。RR在DNA合成和修復中的重要作用使其成為抗癌和抗病毒藥物的重要靶點[6]。目前應(yīng)用的RR抑制劑不良反應(yīng)仍較明顯，開發(fā)更有效、不良反應(yīng)更小的RR抑制劑勢在必行。

1 RR的分類結(jié)構(gòu)與功能調(diào)控

RR種類以及數(shù)量在不同種類生物以及不同階段細胞周期存在一定差異，目前以與RR結(jié)合的金屬輔酶因子差異可分為三類。Ⅰ類主要在哺乳動物、植物、酵母以及藻類等真核生物中大量存在，在原核生物以及病毒中也可發(fā)現(xiàn)，包含結(jié)構(gòu)Fe-o-Fe，由兩個亞基二聚體構(gòu)成。根據(jù)RR多肽序列的同源性和酶的變構(gòu)特征，Ⅰ類RR被進一步分為三個亞類：Ⅰa、Ⅰb和Ⅰc。其中Ⅰa主要存在于真核、原核、噬菌體以及病毒體中，而Ⅰb則主要存在于原核生物中，人類RR屬于Ⅰ類。第Ⅱ類RR主要存在于乳酸菌、古真菌以及真細菌中，由兩個亞基構(gòu)成。第Ⅲ類RR為厭氧酶類，主要在厭氧噬菌體、古真菌、大腸桿菌以及真細菌中分布，包含亞基結(jié)構(gòu)4Fe-4S，由兩個大小不等的亞基二聚體構(gòu)成[7]。通過分析三類RR結(jié)構(gòu)也可發(fā)現(xiàn)，雖然氨基酸序列同源性較低，但其三級結(jié)構(gòu)卻具有較為相似的活性中心結(jié)構(gòu)。第Ⅰ類的Ⅰa與Ⅰb兩個亞類具有較大的蛋白序列差異。而同一類型RR在不同種類生物中所具有的相似性卻較高。

人類的核糖核苷酸還原酶主要由大亞基M1和小亞基M2組成，大亞基M1和小亞基M2均為二聚體結(jié)構(gòu)，只有在全酶結(jié)構(gòu)亞基形成異四聚體結(jié)構(gòu)后才具有活性[8]。其中M1定位于染色體1 lp15.5，存在結(jié)合底物及變構(gòu)效應(yīng)物的部位，并且其包含的琉基可直接供給電子，對底物特異性及酶活性發(fā)揮控制作用。RRM2基因主要存在于人染色體2p25-p24，是一個8個長螺旋結(jié)構(gòu)折疊形成的同源二聚體，包含一個酪氨酸自由基與兩個二價鐵核心，在催化過程中可有效觸發(fā)電子運輸。M2是鐵硫蛋白的一種，借助酪氨酸殘基苯環(huán)產(chǎn)生特異性自由基而參與到催化反應(yīng)過程中，其所攜帶的接觸抑制區(qū)能夠?qū)Φ孜镛D(zhuǎn)化功能發(fā)揮控制作用，因此M2兼具催化與控制作用[9]。

哺乳動物細胞中存在多種RR活性的調(diào)節(jié)方式。細胞內(nèi)RR水平與細胞所處生長周期密切相關(guān)，R1和R2基因的轉(zhuǎn)錄受細胞周期調(diào)控，在G0/G1期細胞中檢測不到其mRNA，R1和R2 mRNA在S期的表達達到最大水平[10]。R1蛋白的半衰期長達18～24 h，在增殖細胞中其含量幾乎恒定，在整個細胞周期中相對過量。R2蛋白則為S期特異表達，其半衰期較短，約為3～4 h。R2蛋白合成開始于晚期G1期或早期S期，迅速降解后在細胞中緩慢積累直至有絲分裂晚期[11]。因此，酶活性取決于R2蛋白水平的高低。

DNA合成和修復很大程度上依賴于脫氧核糖核苷酸池的平衡，dNTPs水平及其相對量的失衡可導致細胞死亡或遺傳代謝異常[12]。作為DNA聚合酶底物，dNTP影響復制的全部過程。在哺乳動物細胞中，總dNTP池在S期期間達到峰值，以支持細胞核DNA的復制，而G0/G1期時，dNTPs用于DNA修復和線粒體DNA合成，此時dNTP池僅為S期時的十分之一。不平衡的dNTP池易導致DNA錯誤插入和校對受損來增強突變[13]：不同種類dNTPs在與模板堿基配對時相互競爭可能導致DNA的錯誤插入，并且過量存在的dNTP可能很容易導致錯摻的發(fā)生；在dNTP濃度升高的情況下，DNA聚合酶校正減少，這種現(xiàn)象又被稱為下一核苷酸效應(yīng)，于是在堿基錯誤插入后，還未及時去除錯配的核苷酸，DNA鏈便已延伸從而導致突變。不受控制的增殖是癌癥的特征[14]，因此，作為提供和調(diào)節(jié)dNTPs含量的RR，其活性高低是DNA合成和修復的關(guān)鍵，對于細胞增殖發(fā)揮了重要作用，對腫瘤生物學行為、腫瘤轉(zhuǎn)移及耐藥均有重大影響。

2 RR作為癌癥治療的新靶點

RR負責維持DNA合成和修復所需的dNTP的平衡，在細胞增殖中起著重要的作用[5]。RR在細胞中可發(fā)揮降低細胞內(nèi)dNTP的濃度，抑制DNA合成，抑制靜止細胞中的DNA修復，以及細胞周期阻滯和凋亡的作用[15]。在腫瘤細胞中，因細胞增殖對于dNTP的需求增加，對調(diào)節(jié)信號的適應(yīng)性及反應(yīng)性降低，因此腫瘤細胞對RR抑制的細胞毒作用比正常細胞更敏感[16]。在許多研究中，RR活性增加與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有關(guān)，越來越多的證據(jù)表明RR在促進癌癥發(fā)展中發(fā)揮生物學作用。R2不僅可以與各種癌基因協(xié)同作用促進惡變，而且可以增強癌癥的侵襲潛能。故核糖核苷酸還原酶一直被認為是癌癥治療的理想靶點。

Elford等[17]在一系列大鼠肝癌模型中測定腫瘤生長速度，發(fā)現(xiàn)RR活性與腫瘤生長速率之間有著極好的相關(guān)性，在極快速生長和慢速生長的腫瘤細胞之間，RR酶活性的差異可高達200倍。Aird等[18]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、上皮卵巢癌中，RRM2的表達量與腫瘤分級相關(guān)，這也說明在惡性度較高的腫瘤細胞的快速細胞分裂中RRM2發(fā)揮重要的作用。RRM2水平在良性皮膚損傷中較低，但在惡性黑色素瘤中顯著較高，并且較高的RRM2表達與較差的總生存相關(guān)。

田華等[19]關(guān)于RR酶亞基RRM1、RRM2、RRM2B與肝細胞癌患者預(yù)后關(guān)系的研究中，對收集的197例原發(fā)性肝細胞癌患者的肝細胞癌組織標本進行免疫組織化學法分析發(fā)現(xiàn)，RRM1、RRM2、RRM2B蛋白主要表達于肝癌細胞細胞質(zhì)中，RRM2B蛋白高表達的肝癌患者術(shù)后生存時間明顯長于低表達者，并認為RRM2B蛋白表達水平是影響肝細胞癌的獨立預(yù)后因素。大部分RRM1和RRM2定位于細胞質(zhì)并擴散到細胞核中以提供DNA復制所需的dNTP，并可以在細胞核中的DNA損傷位點積聚。

Morikawa等[20]通過免疫組織化學法檢測胃癌組織和正常胃黏膜中RRM2的表達，正常胃黏膜中，核糖核酸還原酶M2亞單位表達局限于胃小凹區(qū)域，表面上皮未見表達。112例胃癌組織中，72例（64.3%）觀察到核糖核酸還原酶M2亞單位過表達，并與男性、浸潤肌層固有層、病毒感染正相關(guān)，但與年齡、組織學分型、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。相關(guān)研究在口腔癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌[21-23]等多種惡性腫瘤中，都已發(fā)現(xiàn)RR存在過表達，并且其過表達與腫瘤預(yù)后差呈正相關(guān)性。

為了從宏觀上評估RR在人類癌癥中的影響，Aye等[8]用ONCOMINE數(shù)據(jù)庫調(diào)查了人類癌癥中的RR基因表達。在對168種癌癥的分析中，RRM2是73種癌癥中過表達最多的基因之一，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌和肉瘤、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等。在對170種腫瘤的分析中，RRM1是30種腫瘤中過表達最多的基因之一，包括腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌，肺癌和肉瘤。相比之下，在對90種腫瘤的分析中，只有5項中p53R2屬于過表達最多的基因之一。

3 RR抑制劑的抗腫瘤作用

基于前文所述，在腫瘤細胞中，因細胞增殖而對于dNTP的需求增加，而RR在細胞中負責維持dNTPs的產(chǎn)生與平衡，因此RR對于腫瘤細胞也是必需的。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)由人為誘導的衰老與RRM2表達的抑制相關(guān)，并且這種抑制可以通過用外源核苷處理或外源性的RRM2來消除[24]?？梢姰惓５腞R表達可以使細胞逃避凋亡，而抑制RR表達使癌細胞對治療敏感。

RR抑制劑作為潛在的抗腫瘤、抗病毒和抗細菌的化療藥物已被廣泛研究。一些RR抑制劑已被證明用于癌癥的臨床治療，另一些正在臨床試驗評估中，根據(jù)不同的標準，RR抑制劑可分為不同的類別。（1）根據(jù)化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，RR抑制劑可分為三類：小分子化合物、合成寡肽和寡核苷酸。（2）根據(jù)作用靶點和作用機制，可分為酶活性抑制劑和基因表達抑制劑，根據(jù)作用部位不同酶活性抑制劑又分為RRM1抑制劑和RRM2抑制劑[25-26]。

RRM1抑制劑包括核苷類似物、底物和變構(gòu)效應(yīng)物類似物、巰基失活劑等。其中底物類似物具有脫氧胞苷類似物2’碳結(jié)構(gòu)修飾，被RR識別為正常底物并與R1的酶活性中心結(jié)合，導致使酶失活，也被稱為自殺抑制劑。RRM2抑制劑包括自由基清除劑、鐵離子鰲合劑和RRM1-RRM2聚合阻斷劑。基因表達抑制劑則從mRNA水平和蛋白水平下調(diào)基因的表達水平，包括反義寡核苷酸和siRNA等[5]。

李夢熊等[27]構(gòu)建了宮頸癌細胞系Siha/Gem耐藥細胞，反轉(zhuǎn)錄檢測結(jié)果顯示Siha細胞RRM2 mRNA的表達低于Siha/Gem耐藥細胞，通過RNA干擾技術(shù)敲低RRM2表達，處理后Siha/Gem耐藥細胞中RRM2 mRNA表達較處理前明顯降低，提示宮頸癌細胞系的RRM2表達增強可能是導致宮頸癌細胞對Gem繼發(fā)耐藥的因素。在Siha/Gem耐藥細胞中通過RNA干擾后Siha/Gem細胞的RRM2基因表達水平明顯受到抑制，同時Siha/Gem細胞對Gem的敏感度增加，提示敲低RRM2表達可以逆轉(zhuǎn)細胞對吉西他濱的耐藥性。

張夢等[28]通過小干擾RNA（siRNA）介導RRM2沉默，轉(zhuǎn)染順鉑誘導的卵巢癌耐藥細胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RRM2-siRNA可以逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細胞株的DDP耐藥性，使細胞對DDP的敏感度顯著上調(diào)，RRM2的表達水平對卵巢癌治療效果也具有一定的預(yù)測作用，RRM2可以作為逆轉(zhuǎn)DDP耐藥的卵巢癌患者治療的分子靶點。

Karlsson等[29-30]研究發(fā)現(xiàn)RRM2在子宮內(nèi)膜癌細胞中具有較高的表達水平，在siRNA抑制RRM2表達影響子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞侵襲、增殖能力的實驗中，通過在Ishikawa細胞中導入siRNA片段，對細胞轉(zhuǎn)染率、細胞周期及凋亡率進行觀察，發(fā)現(xiàn)siRNA可有效抑制癌細胞的增殖和侵襲，并且可誘導細胞凋亡，減少了RRM2在mRNA上的表達水平；由此說明siRNA在多種腫瘤細胞中均可有利于降低RRM2表達水平，使細胞侵襲和增殖能力降低，對細胞凋亡及生長停滯發(fā)揮促進作用。

吉西他濱是臨床上最常見的RRM1抑制劑，相關(guān)研究認為高表達RRM1較低表達RRM1能顯著提高患者的總體生存率和無病生存期。RRM1的表達水平可以作為臨床上評估吉西他濱治療胰腺癌患者預(yù)后的指標之一[31]。

4 RR抑制劑新藥物開發(fā)研究

近年來，出現(xiàn)了許多新的藥物研發(fā)策略，包括基因組和蛋白質(zhì)組學方法，如基因表達微陣列，內(nèi)含硅和基于片段的篩選技術(shù)，用于合理藥物設(shè)計。新的結(jié)構(gòu)生物學方法和先進的化學技術(shù)，如高通量X射線晶體學和核磁共振，將為今后發(fā)現(xiàn)更有效的抗腫瘤藥物RR抑制劑提供新的基礎(chǔ)[32]。

目前應(yīng)用的RR抑制劑都有其缺點。例如，羥基脲對RR具有低親和力；3-氨基吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲雖然具有較強的抑制作用，但鐵螯合能力也較強，其ROS作用機制不僅可引起RR抑制和DNA損傷，還可引起高鐵血紅蛋白、缺氧、呼吸窘迫等不良反應(yīng)[33]。不斷的探索發(fā)現(xiàn)新的RR抑制劑，設(shè)計新靶向因子的亞單位抑制劑，使其具有較高的親和力和選擇性，是未來一代藥物的發(fā)展方向。

5 結(jié)語

RR是最高度保守的酶之一，是生物DNA合成所必需的酶。關(guān)于RR的新研究加深了我們對RR酶在各種癌癥發(fā)展中的認識。RR不僅發(fā)揮著提供dNTP的基本功能，而且每個獨立的三個小亞基蛋白RRM1、RRM2和p53R2都在癌癥發(fā)展中獨立發(fā)揮著作用，因此RR在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用。

RR抑制劑的臨床應(yīng)用已有幾十年的歷史，然而目前應(yīng)用的RR抑制劑并不能覆蓋臨床需求。因此設(shè)計與開發(fā)新型RR是未來抗腫瘤策略的重要方向。繼續(xù)尋找新的RR抑制靶點，應(yīng)用新的藥物研究策略，將為今后發(fā)現(xiàn)更有效的RR抑制劑提供有效的助力。