外泌體在胰腺癌診治中的研究進(jìn)展

張馳綜述，任慶蘭審校

0 引言

胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤。絕大部分胰腺癌患者確診時(shí)已是晚期，其中不能手術(shù)切除和發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分別占27%和53%[1]。故胰腺癌的早期診斷和治療顯得尤為重要。近期研究表明，外泌體能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、新生血管生成及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成，介導(dǎo)機(jī)體免疫抑制，參與化療耐藥性形成等。本文將對外泌體在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為胰腺癌早期診治提供新思路。

1 外泌體的概述

1.1 生物學(xué)特性

外泌體在1983年被首次報(bào)道，4年后研究者運(yùn)用離心分離法從羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中分離出具有一定生物學(xué)活性的囊泡狀結(jié)構(gòu)并正式命名為“外泌體”。目前研究表明，外泌體是直徑為30～100 nm的來源于核內(nèi)體的一種細(xì)胞外囊泡結(jié)構(gòu)，包含核酸、蛋白質(zhì)等多種活性成分，通過傳遞內(nèi)部的活性成分參與細(xì)胞間通訊從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用[2]。各種生理或病理狀態(tài)下，外泌體可由造血細(xì)胞、血小板、神經(jīng)元細(xì)胞、免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等不同類型細(xì)胞合成分泌，在血漿、尿液、唾液、惡性胸腹腔積液等體液中廣泛分布[3-4]。外泌體形成過程：首先通過細(xì)胞內(nèi)吞產(chǎn)生早期核內(nèi)體，隨后核內(nèi)體膜向內(nèi)凹陷在其內(nèi)部形成許多小囊泡，稱為晚期核內(nèi)體或多囊泡體，最后，多囊泡體與胞膜融合將管腔內(nèi)的核內(nèi)體小囊泡釋放到胞外形成外泌體[5]。外泌體通過介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、影響機(jī)體免疫應(yīng)答、參與炎性反應(yīng)和凝固反應(yīng)等方式影響多種生理病理過程，對研究腫瘤、神經(jīng)退行性變、感染和自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療具有重要價(jià)值[6-7]。

1.2 組成成分

外泌體由蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)構(gòu)成，據(jù)外泌體內(nèi)容物數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（www.exocarta.org）最新統(tǒng)計(jì)，在不同組織及細(xì)胞來源的外泌體中存在有41 860種蛋白質(zhì)、4 946種mRNA和1 116種脂質(zhì)。幾乎所有外泌體有如下蛋白質(zhì)[8]：（1）細(xì)胞骨架蛋白，如肌動(dòng)蛋白；（2）與多囊泡體生物起源相關(guān)的蛋白質(zhì)，如腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）；（3）膜轉(zhuǎn)運(yùn)及融合蛋白，包括膜聯(lián)蛋白、Rab蛋白；（4）四次跨膜蛋白超家族，如CD9、CD63、CD81。外泌體包含不同種類的核酸，如雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈DNA（ssDNA）、線粒體DNA（MtDNA）、信使RNA（mRNA）、微小RNA（microRNA）、核小RNA（snRNA）、非編碼RNA（ncRNA）和小細(xì)胞質(zhì)RNA（small cytoplasmic RNA）等[9]。外泌體還含有豐富的脂質(zhì)，包括膽固醇、甘油二酯、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸等。其外膜由富含膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)雙分子層組成，具有較高的穩(wěn)定性，使其內(nèi)部活性物質(zhì)免受降解[10]。

2 外泌體與胰腺癌

2.1 外泌體促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及新生血管形成

Takikawa等[11]報(bào)道胰腺星狀細(xì)胞活化產(chǎn)生的miR-21-5p陽性的外泌體能顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移。磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（glypican 1,GPC1）是腫瘤源性外泌體內(nèi)的一種蛋白多糖，Whipple等[12]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPC1陽性組的胰腺癌細(xì)胞增殖速率和新生血管形成速率均顯著高于GPC1陰性組，提示GPC1陽性的外泌體能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖及新生血管形成。另有研究表明，胰腺癌細(xì)胞可分泌富含miR-1246和miR-1290的外泌體，高表達(dá)的miR-1290通過增加胰腺星狀細(xì)胞中平滑肌肌動(dòng)蛋白及纖維化相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)增生[13]。

2.2 外泌體促進(jìn)胰腺癌侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

Costa-Silva等[14]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌分泌的外泌體中的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）通過激活纖維化信號(hào)通路使肝臟星狀細(xì)胞產(chǎn)生大量纖連蛋白并募集大量巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成，介導(dǎo)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移。有報(bào)道稱胰腺癌細(xì)胞可產(chǎn)生環(huán)狀RNA IARS（Circular RNA IARS, Circ-IARS）陽性的外泌體，Circ-IARS過表達(dá)使miR-122、ZO-1表達(dá)下調(diào)，RhoA、F-actin表達(dá)上調(diào)，并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進(jìn)胰腺癌侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)低氧情況下胰腺癌外泌體中的miR-301a-3p通過刺激PTEN/PI3Kγ信號(hào)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2亞型轉(zhuǎn)化促進(jìn)胰腺癌的遷移、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且外泌體miR-301a-3p水平與胰腺癌的侵襲深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期TNM階段和不良預(yù)后呈正相關(guān)。

2.3 外泌體可介導(dǎo)機(jī)體免疫抑制

腫瘤源性外泌體通過抑制免疫細(xì)胞生長、分化、成熟或通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而抑制機(jī)體免疫功能。Javeed等[17]發(fā)現(xiàn)胰腺癌分泌的外泌體通過誘導(dǎo)精氨酸酶和活性氧表達(dá)、影響STAT3信號(hào)通路使正常單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻庖咭种谱饔玫膯魏思?xì)胞，抑制機(jī)體免疫功能。Zhou等[18]研究指出胰腺癌外泌體中高表達(dá)的miR-203通過下調(diào)腫瘤壞死因子α（TNFα）、toll樣受體4（TLR4）、白細(xì)胞介素12（IL-12）等細(xì)胞因子表達(dá)水平抑制樹突狀細(xì)胞的抗原提呈及激活作用，從而干擾抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤源性外泌體通過干擾白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子β（TNFβ）等細(xì)胞因子相關(guān)的免疫活化通路引起免疫抑制，還可激活FasL途徑、半乳糖凝集素9途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞凋亡[19]。

2.4 外泌體介導(dǎo)胰腺癌化療耐藥形成

Patel等[20]研究證實(shí)暴露于吉西他濱的胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體能介導(dǎo)化療耐藥形成，基因分析提示胰腺癌耐藥細(xì)胞中SOD2、CAT基因（用于編碼活性氧物質(zhì)降解酶的基因）表達(dá)上調(diào)，而DCK基因（用于編碼吉西他濱代謝酶的基因）表達(dá)下調(diào)，當(dāng)miR-155功能抑制或者DCK表達(dá)恢復(fù)可解除胰腺癌細(xì)胞獲得性耐藥。另有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的外泌體通過傳遞miR-365到胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞內(nèi)使胞苷脫氨酶表達(dá)增加，后者可使吉西他濱代謝失活，誘導(dǎo)胰腺癌化療耐藥形成[21]。

2.5 外泌體在胰腺癌診斷中的價(jià)值

目前針對胰腺癌常規(guī)的檢查手段主要包括CT、MRI等影像學(xué)檢查及CA19-9等腫瘤標(biāo)志物檢測，其對早期胰腺癌診斷效果欠佳，大部分患者確診時(shí)已是中晚期，尋找準(zhǔn)確、敏感的胰腺癌早期檢測手段是胰腺癌診療的重中之重。

美國安德森癌癥中心一項(xiàng)研究證實(shí)，早期胰腺導(dǎo)管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）患者血清中的GPC1陽性的循環(huán)外泌體（GPC1+crExos）水平顯著高于無病人群或慢性胰腺炎患者，行腫瘤切除術(shù)后的患者體內(nèi)GPC1+crExos水平顯著下降，其特異性及敏感度均優(yōu)于目前常用的CA19-9，可將胰腺癌患者與胰腺良性病變及無病人群有效區(qū)分開[22]。該研究還發(fā)現(xiàn)，與MRI等傳統(tǒng)影像學(xué)檢查相比，GPC1+crExos敏感度更高，假陽性率更低。且GPC1+crExos水平增高與腫瘤大小和腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)。因此研究者認(rèn)為GPC1+crExos可作為一種可靠的胰腺癌早期診斷標(biāo)志物。

Lai等[23]發(fā)現(xiàn)PDAC患者的外泌體miR-l0b、miR-21、miR-30c和miR-181a呈高表達(dá)，而miR-let7a呈低表達(dá)，將上述外泌體miRNA進(jìn)行聯(lián)合檢測可將胰腺癌患者與正常人和慢性胰腺炎患者區(qū)別開，其在胰腺癌早期診斷方面優(yōu)于CA19-9和GPC1。Sharma等[24]實(shí)驗(yàn)證實(shí)磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）陽性的外泌體水平在影像學(xué)能夠檢測到胰腺癌變前已發(fā)生顯著增高，提示其可作為潛在的胰腺癌早期診斷標(biāo)志物。有中國學(xué)者發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-23b-3p可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲、擴(kuò)散及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其在胰腺癌患者血清中的含量顯著高于正常受試者及慢性胰腺炎患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[25]。有研究表明，胰腺癌患者血清中外泌體miR-191、miR-21、miR-451a水平與對照組相比顯著增高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示三種外泌體miRNA聯(lián)合檢測在診斷準(zhǔn)確度和曲線下面積均優(yōu)于外泌體miRNA單項(xiàng)檢測[26]。

2.6 外泌體在胰腺癌治療中的價(jià)值

外泌體可由機(jī)體絕大多數(shù)細(xì)胞合成分泌，可攜帶蛋白質(zhì)、DNA、RNA等物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可作為腫瘤治療藥物的理想載體，被認(rèn)為是抗腫瘤治療的重要工具。KRAS基因突變常見于胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤，為PDAC患者中最常見的突變類型，在PDAC患者中突變率約為88%～100%[27]。Kamerkar等[28]利用經(jīng)修飾的外泌體（iExosomes）作為載體，裝載針對KRAS基因的特異性的靶向物質(zhì)—siRNA、shRNA，siRNA和shRNA以kRasG12D基因?yàn)榘悬c(diǎn)能顯著抑制KRAS突變基因表達(dá)。將載有siRNA及shRNA的iExosomes注入胰腺癌小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并提高胰腺癌小鼠總生存率。Sun等[29]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織與正常胰腺組織相比MiR-506水平顯著降低，當(dāng)胰腺癌組織中MiR-506水平增高時(shí)可直接靶向激活STAT3-BCL2-BECN1軸誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬凋亡，抑制腫瘤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，運(yùn)用外泌體作為載體靶向運(yùn)送miR-506至胰腺癌細(xì)胞中有望為胰腺癌治療帶來新的曙光。

吉西他濱作為胰腺癌標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，在胰腺癌患者中耐藥率較高，近期研究表明外泌體在介導(dǎo)胰腺癌化療耐藥形成中扮演關(guān)鍵角色，研究其具體的耐藥機(jī)制能為胰腺癌患者提供新的治療手段。Richards等[30]發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancerassociated fibroblasts, CAFs）對吉西他濱具有天然耐藥性，CAFs在吉西他濱作用下通過釋放microRNA-146陽性外泌體作用于胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)化療耐藥形成，當(dāng)加入GW4869（一種外泌體釋放抑制劑）抑制CAFs外泌體釋放后，胰腺癌細(xì)胞存活率顯著降低。Mikamori等[31]研究證實(shí)暴露于吉西他濱的PDAC細(xì)胞miR-155表達(dá)增加，能誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞化療耐藥形成，獲得性耐藥的PDAC細(xì)胞通過釋放miR-155陽性外泌體介導(dǎo)周圍PDAC細(xì)胞化療耐藥形成，該研究為胰腺癌治療提供了新靶點(diǎn)。Aspe等[32]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)載有生存素T34A（Survivin-T34A）的外泌體與吉西他濱聯(lián)合使用可顯著促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，并增加吉西他濱化療敏感度。

2.7 外泌體在胰腺癌預(yù)后判斷中的價(jià)值

近期安德森癌癥中心學(xué)者[33]通過檢測胰腺癌患者血清中的外泌體DNA（exoDNA）和循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA（ctDNA）水平發(fā)現(xiàn)：在34例潛在可切除的腫瘤患者中，新輔助治療后exoDNA水平的增加與疾病進(jìn)展顯著相關(guān)，而ctDNA未顯示與胰腺癌預(yù)后的相關(guān)性；在多變量分析中exoDNA中突變等位基因片段（MAFs）≥5%是無進(jìn)展生存期、總生存期的顯著預(yù)測因子；縱向分析中exoDNA中MAF峰值高于1%與影像學(xué)進(jìn)展顯著相關(guān)。Takahasi等[34]研究證實(shí)miR-451a陽性外泌體在術(shù)后復(fù)發(fā)的PDAC患者中顯著增高，miR-451a高表達(dá)提示更短的總生存期和無病生存期，可作為PDAC患者一個(gè)重要的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究報(bào)道外泌體中的環(huán)狀RNA PDE8A（circ-PDE8A）通過激活MACC/MET/ERK或AKT信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌侵襲性生長，外泌體中circ-PDE8A高表達(dá)提示胰腺癌患者病情進(jìn)展和預(yù)后不良[35]。

3 總結(jié)及展望

外泌體是一種分布廣泛的細(xì)胞多囊泡體，通過傳遞其內(nèi)容物調(diào)控靶細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和基因表達(dá)，從而激活或抑制相應(yīng)生理和病理過程。外泌體能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥性形成，介導(dǎo)機(jī)體免疫抑制，在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為胰腺癌的早期診治提供了新思路。但目前相關(guān)臨床研究樣本量較小，外泌體用于胰腺癌診斷和治療的機(jī)制有待進(jìn)一步探索，臨床應(yīng)用存在較大限制。隨著相關(guān)研究不斷深入，外泌體有望為胰腺癌患者的早期診治帶來新的曙光。