雞法氏囊和腺病毒精制卵黃抗體制備與應(yīng)用

吳衛(wèi)東 魏中鋒 徐梅 蔡文利

（1，山東省菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院 274000；2，山東省菏澤市動物疫病預(yù)防控制中心 2740001）

雞法氏囊?。↖BD）是一種急性、高度傳染性可引起免疫抑制性的雞的烈性傳染病[1]。近幾年，雞法氏囊和腺病毒對目前雞養(yǎng)殖業(yè)已造成重大危害，尤其在有些地區(qū)還存在禽法氏囊和腺病毒混合感染的情況。本試驗用從當(dāng)?shù)胤蛛x的雞法氏囊和腺病毒流行株病毒制備成二聯(lián)油佐劑滅活疫苗后，經(jīng)過對150日齡的蛋雞進行3 次免疫后，制備出抗雞法氏囊和腺病毒二聯(lián)精制卵黃抗體，有望對當(dāng)?shù)仉u法氏囊和腺病毒疫情進行有效控制。

1 材料

1.1 毒株及疫苗

毒株為由本實驗室分離鑒定的當(dāng)?shù)亓餍兄?，疫苗為本實驗室制備的雞法氏囊和腺病毒二聯(lián)滅活油乳劑疫苗。

1.2 試驗雞

卵黃抗體雞有本地某種蛋雞養(yǎng)殖場提供150日齡產(chǎn)蛋雞50只，SPF 雞購自濟南斯帕法斯家禽有限公司。

1.3 試驗主要儀器

電子天平購自日本島津 (Shimadzu) 公司、高速冷凍離心機購自德國SIGMA/西格瑪公司。

1.4 試驗試劑

法氏囊瓊擴標(biāo)準(zhǔn)抗原、法氏囊瓊擴標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，雞腺病毒I 亞群IV 型瓊擴標(biāo)準(zhǔn)抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購江蘇農(nóng)科院家禽研究所。聚乙二醇6000 購自江蘇省海安石油化工廠。

2 方法

2.1 產(chǎn)蛋雞免疫

對試驗產(chǎn)蛋雞每只雞頸部皮下注射雞法氏囊和腺病毒二聯(lián)滅活疫苗0.5ml/只，2 周后加強免疫胸部肌肉注射滅活疫苗0.5ml/只，在第4 周后進行最后一次加強免疫頸部皮下和腿部肌肉各注射滅活疫苗0.5ml/只。

2.2 免疫雞抗體效價監(jiān)測

在產(chǎn)蛋雞免疫后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4 個月、6 個月時分別對所有免疫雞翅靜脈采血1.0ml，分離血清。采用瓊脂擴散方法分別測定雞法氏囊和腺病毒抗體效價。

2.3 卵黃抗體的提取

參考Ismeal Marcet 等[2]中的方法進行卵黃抗體提取，在產(chǎn)蛋雞注射疫苗后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4個月、6 個月時采集免疫蛋雞雞蛋，用清水將雞蛋外部清洗干凈，對雞蛋殼表面用75%酒精消毒處理，敲開蛋殼，用卵黃分離器分離蛋黃，挑破卵黃膜，無菌收取卵黃液，充分混勻。將收取的卵黃液和 pH7.6，0.1M 的 Tris．HCI 緩沖液按 1:2 充分混勻，加入 PEG6000 粉攪拌，使 PEG6000 最終濃度為 3.5% (W/V)，勻速攪拌使 PEG6000 完全融化，室溫孵化 30min。用高速冷凍離心機 4℃、8000prm 離心 20min，然后用 0.45gm 微孔濾膜過濾，向上清液中加PEG6000 至終濃度為12%獲取沉淀，用定量PBS 溶液溶解沉淀即為精制卵黃抗體溶液。

2.4 卵黃抗體監(jiān)測

在試驗蛋雞注射疫苗后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4 個月、6 個月后分別提取卵黃中的抗體，采用瓊脂擴散試驗方法分別測定雞法氏囊和腺病毒卵黃抗體效價。

2.5 卵黃抗體質(zhì)量檢測

按照獸藥典中的規(guī)定方法進行無菌檢驗、安全性檢驗、抗體效價檢測等常規(guī)檢驗。

2.6 臨床應(yīng)用試驗

購買 90 只 21日齡的 SPF 雞，每組 30 只，分為對照組、免疫組、治療組，對照組每只雞皮下注射滅菌生理鹽水0.5ml，注射后3d，所有雞點眼接種法氏囊強毒和肌肉注射腺病毒強毒，接種量為 0.1ml/只，免疫組每只雞肌肉注射卵黃抗體0.5ml，3d 后，再接種法氏囊和腺病毒強毒，治療組接種法氏囊和腺病毒病毒液0.1ml/只，待雞出現(xiàn)臨床癥狀后立即腿部肌肉注射卵黃抗體0.5ml/只，3 組雞隔離飼養(yǎng)，專人飼喂，每日記錄每只雞的臨床癥表現(xiàn)和發(fā)病死亡情況，對死亡的雞解剖檢驗，記錄病理變化。

3 結(jié)果

3.1 產(chǎn)蛋雞免疫抗體結(jié)果

在疫苗免疫后，免疫組蛋雞血清抗體效價逐漸提高，在首免2 周后即法氏囊和腺病毒抗體效價分別為3.8log2 和4.2log2，至首次免疫后2 個月后抗體效價達到峰值8.1log2 和8.6log2，隨后開始維持在一定水平，至免疫后6 個月，法氏囊和腺病毒的抗體效價仍維持在7.3log2 和7.5log2 以上。

3.2 卵黃抗體監(jiān)測結(jié)果

在疫苗免疫后 1 周、2 周、3 周、4 周、2 個月、3 個月、4個月、6 個月監(jiān)測提取的卵黃抗體中的法氏囊和腺病毒抗體效價，在首免3 周后，免疫組蛋雞卵黃中法氏囊和腺病毒的抗體效價逐漸提高，至首次免疫后3 個月抗體效價達到峰值8.6log2和8.7log2，隨后開始維持在一定水平，至免疫后6 個月，法氏囊和腺病毒抗體效價仍維持在7.4log2 和7.6log2 以上。經(jīng)檢測，免疫蛋雞的血清抗體上升規(guī)律與卵黃抗體基本一致，但卵黃抗體的增長趨勢較血清抗體推遲5～7d，開始時卵黃抗體效價低于血清抗體效價，這可能是血清中抗體來源于血清，而逐步轉(zhuǎn)移至卵黃需要一段時間。

3.3 免卵黃抗體的質(zhì)量檢驗

3.3.1 無菌檢驗結(jié)果

取高免卵黃抗體0.2ml，分別接種于鮮血瓊脂平板、馬丁肉湯和厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72h，均未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長。

3.3.2 卵黃抗體安全性試驗

將制備好的卵黃抗體注射21日齡健康SPF 雞10 只，每只雞頸部皮下注射卵黃抗體3ml，觀察14d，未發(fā)現(xiàn)接種雞死亡和接種部位有不良反應(yīng)發(fā)生。

3.4 臨床試驗結(jié)果

對照組雞在用法氏囊和腺病毒液攻毒后出現(xiàn)發(fā)熱、精神萎靡、拉黃綠糞便等臨床癥狀，7d 后所有對照組雞全部死亡，解剖可見心包大量積液、肝臟腫大淤血、腺胃乳頭腫大出血、法氏囊出血、腿部胸部肌肉出血等法氏囊和腺病毒感染的典型病理變化。

免疫組在注射卵黃抗體3日后攻毒，在14d 內(nèi)只有1 只雞死亡，其余雞未表現(xiàn)出食欲減退、精神萎靡等臨床表現(xiàn)，將免疫組雞宰殺、解剖后，內(nèi)臟器官未見任何病理變化，表明接種卵黃抗體0.5ml 的免疫組在免疫3d 后能完全抵抗法氏囊和腺病毒強毒株的攻擊，卵黃抗體預(yù)防法氏囊和腺病毒的效果較好，預(yù)防保護率達96.7%。

治療組在攻毒后4d 后出現(xiàn)臨床癥狀時及時注射卵黃抗體進行治療，在3d 后絕大多數(shù)雞精神恢復(fù)正常，在14d 內(nèi)只有兩只雞死亡，其余未死亡。本試驗表明，制備的卵黃抗體對法氏囊和腺病毒強毒株感染具有顯著的治療效果，治愈率達93.3%。

4 討論與小結(jié)

本試驗利用本地分離鑒定的法氏囊和腺病毒流行株制備疫苗，在通過多次免疫產(chǎn)蛋雞，利用PEG6000 提取和微孔濾膜過濾獲得精制卵黃抗體，試驗結(jié)果顯示，制備的雞法氏囊和腺病毒二聯(lián)卵黃抗體對強毒感染的預(yù)防保護率為96.7%，治愈率為93.3%。對本地區(qū)法氏囊和腺病毒疫病的流行控制有極其重要的意義，尤其對一些肉雞養(yǎng)殖場經(jīng)常發(fā)生法氏囊和腺病毒混合感染可起到有效控制[2]。