關于雞大腸桿菌病的分離鑒定及藥敏實驗探討

石哲銘

（新疆石河子大學動物科技學院 832003）

家禽大腸桿菌是非常常見的病原菌，此病經(jīng)常發(fā)生在養(yǎng)殖場中，較為嚴重。為了控制此病毒，獸醫(yī)在臨床上開始研發(fā)控制此病毒的藥物，各種控制藥物接踵而來，導致大腸桿菌耐藥菌株出現(xiàn)，耐藥性的變大加劇了抗菌藥物在畜禽體內的殘留，給養(yǎng)禽業(yè)長期發(fā)展帶來危害。

1 大腸桿菌病概述

大腸桿菌病是由埃希氏菌導致的禽類腸道傳染病。此病為革蘭氏陰性，擁有一些周鞭毛與菌毛。造成胚胎死亡、臍炎、氣囊病等病癥，還會和其余細菌病毒同時發(fā)病。發(fā)病時雞的精神恍惚、不思飲食，更為嚴重的是出現(xiàn)呼吸受阻、排血便等情況[1]。從一些相關資料可以看出，全國由于感染毒素性大腸桿菌病死亡的人數(shù)高達80 萬（針對5 歲以下兒童）。最為嚴重的很多地區(qū)大腸桿菌在腹瀉病人的病原譜中占據(jù)首位，在國外便發(fā)生過類似事情，大腸桿菌曾經(jīng)引發(fā)過食品污染事故，致病性非常嚴重，經(jīng)常會造成患者腹瀉、脫水更為嚴重的是死亡[2]。在獸醫(yī)學上，大腸桿菌一年四季都會發(fā)病，死亡率非常大，需格外注意。此外，在有關大腸桿菌病防治中提出，此病在全部家禽中發(fā)病率非常高，且病程時間長，容易與其他呼吸道疾病產生混合感染，這也變?yōu)榇竽c桿菌最為主要的特點。感染大腸桿菌病不僅會導致家禽生產能力降低，還會在一定程度上影響產品質量。在20世紀80年代，我國養(yǎng)殖業(yè)集中化得到提升，畜禽大腸桿菌病在各地盛行，絲毫不會受到其他傳染因子的影響，大腸桿菌感染仍處于首要位置，較為影響我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。

2 大腸桿菌分離、鑒定以及藥敏實驗

大腸桿菌在一些哺乳動物中，屬于正常菌群，在飼料、飲水、孵化場等地較為常見，此病傳染主要是大腸桿菌飼料、飲水、呼吸道、消化道等路徑實施傳播的。然而，由于大腸桿菌發(fā)病沒有顯著的季節(jié)性，四季都有可能發(fā)生。在冬季與氣候多變的地方，各種家禽都有可能發(fā)生[3]。尤其是孵化過程、種蛋內等死胚分離頻率較高。當存在其他病原體感染，發(fā)生大腸桿菌感染率會更為嚴重?；诖?，相關專業(yè)人士針對雞大腸桿菌進行分離、鑒定并實施了藥敏實驗，取得顯著結果。

2.1 材料

選擇40 份大腸桿菌感染的病例，運用較為突出的病變心血與肝臟組織對細菌實施分離與鑒定。選擇培養(yǎng)基與藥敏紙片。牛肉膏、微量元素發(fā)酵管，藥敏紙片涵蓋頭孢啉、頭孢他啶、萬古霉素、左氟沙星等，購買于某某試劑有限公司。選用健康的小白鼠為實驗動物，總共50 只，體重大約為22g。

所選用的設備及儀器主要有各類顯微鏡（其中具體指光學顯微鏡）、恒溫箱、為保證實驗的無污染性更需要應用高壓滅菌器、無菌實驗臺等物品。除此之外，還應用大量培養(yǎng)基與試劑來提高本次實驗的準確性，具體有麥康凱瓊脂 (NA)、伊紅美蘭瓊脂、普通肉湯等，而所應用到的所有培養(yǎng)基全是根據(jù)《獸醫(yī)微生物實驗指導》配置而成。其中，利用硝酸鹽作為還原劑，氧化酶試劑及其他實驗相關的微量生化試管、藥敏紙片。

2.2 病料的采集方式與方法

在本次實驗中，主要選取了6 個出現(xiàn)病死雞的雞場為主要采集場所，從6 個雞場分別選取一只病死雞為研究對象，利用無菌環(huán)境取出6 只病死雞的心臟與肝臟，向其分別采取1ml 的血，在此基礎上進行細菌分離培養(yǎng)。之后，利用經(jīng)殺菌后的手術刀片完成臟被膜操作，然后接種環(huán)刺入肝實質取肝樣，開展分離培養(yǎng)的實驗。

2.3 分離培養(yǎng)操作

本次實驗中，每一環(huán)節(jié)均采用無菌操作手段，將選擇到的病料分別放置在普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂上面，然后利用恒溫方式培養(yǎng)24h，并對實驗皿內變化進行觀察。之后在所觀察到的細菌中挑選最為適宜的菌落，用劃線的方式放置于肉湯內，再進行恒溫培養(yǎng)24h。

2.4 鏡檢

本環(huán)節(jié)中，主要是操作人員利用麥康凱瓊脂平板進行新的菌落培養(yǎng)，同樣選擇恒溫培養(yǎng)方式，但培養(yǎng)時間需保持在20h內。然后將涂片上的火焰保持穩(wěn)定，在其上方滴入結晶紫染液，1min 后再進行水洗操作；然后滴加革蘭氏碘液，保持1min 左右的反應后進行水洗操作；滴加95%乙醇脫色，在15～30 后進行水洗，這一步驟要求將染色液全部清洗干凈，避免脫色；之后用番紅染液對清洗干凈的細菌進行復染色，保持1min后水洗，全部干燥后才可以進行鏡檢操作。本次實驗結果顯示，革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)出紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。在此基礎上還對菌體的形態(tài)及染色特征進行實時觀察與記錄。

2.5 致病性實驗

在致病性試驗中，將分離的菌體分別接種于營養(yǎng)肉湯中，保持恒溫狀態(tài)下的培養(yǎng)，這一步驟所利用的設備為恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間為24h；然后選取6 只健康的小白鼠為研究對象，對其進行任意分組，每組3 只；其中，A 組中每只小白鼠腹腔接種的為0.2ml 的肉湯菌液，B 組中每只小白鼠腹腔接種的同樣為0.2ml 的滅菌生理鹽水，然后分別觀察兩組小白鼠的情況。在此基礎上，另外選取6 只健康的7日齡雛雞，將其按照隨機數(shù)理法的方法平均分為兩組，即C 組和D 組。其中，C 組每只雛雞腹腔接種0.2ml 的肉湯菌液；而D 組雛雞腹腔接種0.2ml的滅菌生理鹽水，然后分別對其情況進行觀察與記錄。

2.6 藥敏實驗

首要做的便是進行細菌分離培養(yǎng)與鏡檢。選取病死雞，取其肝，將其做成營養(yǎng)肉湯，恒溫條件下培養(yǎng)1d。之后選擇細菌進行接種，37℃下查看細菌變化情況，并進行涂片，這樣方便在革蘭氏染色鏡下進行檢驗，之后選用單個較為突出的菌落接種鮮血瓊脂斜面，將其保存于4℃冰箱中待用。最后，為了更好地分析可將帶有病菌的物品放進營養(yǎng)湯中，并將其放在37℃的環(huán)境下震蕩，培養(yǎng)18h，查看結果。時間到達后，每株病菌接種4 個小白鼠，并在小白鼠腿部注射帶有病菌的營養(yǎng)湯，另外一組注射滅菌肉湯，每只0.2ml。進而查看小白鼠的發(fā)病率及死亡情況，對那些發(fā)病死亡的小白鼠實施尸體解剖，進而查看有什么病變，并對其實施分離培養(yǎng)。在分離菌肉湯培養(yǎng)中實施葡萄糖、乳糖、蔗糖的發(fā)酵實驗，在微量發(fā)酵管中分別接種細菌，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)。經(jīng)過1d 后觀察結果，其他生化實驗在2～3d 內查看結果。

2.7 實驗結果

從結果上可以看出，全部的分離細菌在普通肉湯中生長得非常好，慢慢搖動液體，會發(fā)現(xiàn)液體呈現(xiàn)云霧狀。本病的傳播主要通過空氣蔓延。所以，在養(yǎng)雞場需及時進行凈化與熏蒸消毒空氣，如果污染較為嚴重，不應實施種蛋，如果在輕度污染上有了糞便，可以采用刀片刮凈。剛出生的小雞對溫度要求非常高，因此，培育小雞期間，需定期帶雞消毒，或者在供暖爐上適當?shù)恼舭l(fā)點食醋，確?？諝鉂駶櫍瑫r也能保證地面干燥，取得的效果非常好。根據(jù)實驗結果，在較為普通的瓊脂上顏色呈灰白色，且表面凸起、邊緣是較為整齊的細菌脫落。從染色體可以看出，分離菌是兩端呈現(xiàn)鈍圓且中等大小，排列較為單一。同時從分離出來的細菌中發(fā)現(xiàn)，其可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽，產酸產氣。融合以上的培養(yǎng)特點和鏡檢結果屬于大腸桿菌。

2.8 藥物敏感實驗結果

通過藥敏實驗可以看出，有15 株雞源致病性大腸桿菌，對頭孢曲松較為敏感，對丁胺那霉素、先鋒、氨曲南等藥物擁有非常高的敏感性，都在一半以上。然而，對于一些慶大霉素、頭孢呋辛、利福平等藥物存在不同程度上的耐藥性，對于環(huán)丙沙星、克拉霉素等有完全的耐藥性。此病最主要的傳播介質是飼料、飲水、空氣，因此，要加強雞舍日常清洗，做好消毒操作。同時，要定期清理水槽，更換雞舍內飲用水，保持雞舍內溫度、濕度均在合理范圍內，減少病菌產生與蔓延的概率。

3 探討

3.1 大腸桿菌產生耐藥性的因素

在動物體內大腸桿菌是常見的細菌，會導致機體抵抗能力減小，引發(fā)大腸桿菌。抗生素與化學藥物在控制大腸桿菌中占據(jù)較為重要的作用。在生產過程中，不合理的運用藥物導致大腸桿菌耐藥性逐漸加重。其中臨床上不合理用藥涵蓋如下幾個方面。（1）沒有在正確的診斷基礎上用藥。（2）再給雞進行用藥時，未根據(jù)規(guī)定進行藥敏實驗，便進行抗菌藥物。（3）對于一些藥物劑量、療程及用藥時機不了解。（4）用藥時選用二線藥物太早。（5）沒有輪流使用藥物，而是長時間選用一種藥物。此外，本次疾病傳播途徑屬于繼發(fā)與混合感染。所以，種雞場需及時進行清理與熏蒸消毒，如果污染較為嚴重，則不應實施種蛋，如果在輕度污染上有了糞便，可以采用刀片刮凈。剛出生的小雞對于溫度要求非常高，因此，培育小雞期間需定期帶雞進行消毒，或者在供暖爐上適當蒸發(fā)點食醋，這樣便能確?？諝鉂駶櫍瑫r也能保證地面干燥，取得的效果非常好。

3.2 適量添加維生素與微生態(tài)制劑，加強機體抵抗力

進行喂養(yǎng)過程中可適量增添VA、VE，家禽可獲得良好的輔助治療。另外，不定時的喂乳酸菌片，可保持雞腸道中菌體不失去平衡，可在一定程度上減小病性大腸桿菌。

3.3 接種免疫疫苗

雞接受免疫疫苗可預防雞大腸桿菌的發(fā)病率，可依照疫苗種類定期對小雞注射免疫接種，所以，需定期對小雞注射一些免疫接種，這樣小雞便能對其有免疫功能，由于大腸桿菌血清型較多，血清抗原體的不一致，其抵抗能力也不同，因此，建議定期為小雞打疫苗。

4 結束語

通過以上分析表明，引起雞大腸桿菌感染的因素有許多，平時應注意正確給雞用藥，尤其是抗病毒藥物。另外，養(yǎng)殖時需提升抗菌藥物的質量監(jiān)督，合理選擇藥物，盡可能杜絕耐藥菌株的發(fā)生。