中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白在銀屑病患兒血清中的表達及致病機制研究

錢革 郭武 尹興平 季江 劉濤 吳劍波 鐘連生河南省兒童醫(yī)院皮膚科，鄭州 0000；無錫市第三人民醫(yī)院皮膚科 000；蘇州大學第二附屬醫(yī)院皮膚科 000；空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科，西安 700；武漢大學中南醫(yī)院皮膚科 0000；徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科 000

銀屑病是由Th1/Th17紊亂介導的以表皮角質(zhì)形成細胞過度增殖和分化異常為特點的慢性炎癥性疾病，皮損部位伴中性粒細胞聚集。中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是一種主要在中性粒細胞中表達的糖蛋白，最先在中性粒細胞的特殊顆粒中發(fā)現(xiàn)［1］。目前已經(jīng)明確，NGAL在炎癥性、損傷性及腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。兒童銀屑病與感染、炎癥關系緊密［2］。本研究中我們觀察NGAL在兒童銀屑病中的表達情況，同時利用人永生化角質(zhì)形成細胞株HaCaT，研究NGAL對表皮細胞分泌細胞因子的影響。

對象與方法

一、對象

2017年1月1日至2018年12月31日在河南省兒童醫(yī)院皮膚科、徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科、武漢大學中南醫(yī)院皮膚科、蘇州大學第二附屬醫(yī)院皮膚科、空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院皮膚科和無錫市第三人民醫(yī)院皮膚科確診為新發(fā)的尋常型銀屑病患兒98例。其中男51例，女47例，年齡3～14（7.00±2.99）歲，病程 3～28（7.4± 5.85）d；其中 34例（34.7%）伴發(fā)熱，65例（66.3%）有咽部紅腫或者扁桃體腫大；43例為急性點滴狀銀屑病。98例患兒均無其他嚴重內(nèi)臟疾病，無過敏性疾病史，就診前1周內(nèi)未用任何藥物治療銀屑病。本研究通過河南省兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（2016-K-031），患兒家長均簽署知情同意書。所有患兒家長同意接受正規(guī)外用和/或系統(tǒng)治療銀屑病方案，外用中弱效糖皮質(zhì)激素軟膏、0.03%他克莫司軟膏、卡泊三醇軟膏或者維A酸類軟膏；伴發(fā)熱、咽部紅腫、扁桃體腫大、外周血白細胞或者中性粒細胞計數(shù)升高者給予系統(tǒng)抗生素治療。

二、細胞與試劑

HaCaT細胞產(chǎn)自上海復祥生物科技有限公司。NGAL酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（徐州微科曼得生物工程有限公司），NGAL蛋白標準品（北京義翹神州科技有限公司），兔抗人白細胞介素22（IL-22）多克隆抗體（美國Abcam公司），兔抗人腫瘤壞死因子α（TNF-α）多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體、堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG、堿性磷酸酶標記馬抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），反轉錄PCR（RT-PCR）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

三、方法

1.患兒病情評分與外周血采集：分別在治療前和接受治療2周后對患兒銀屑病嚴重程度進行評分并采集靜脈血標本?；純翰∏閲乐爻潭劝凑浙y屑病皮損面積及嚴重程度指數(shù)（PASI）評分［3］。每例患兒抽取3 ml外周靜脈血，進行血常規(guī)、生化指標等常規(guī)檢查，剩余血液標本離心15 min（1 728×g）后，取上清液于-80℃凍存。

2.血清NGAL檢測：按照NGAL酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，根據(jù)梯度濃度的NGAL標準品在450 nm處吸光度（A值）繪制標準曲線。將血清標本稀釋1倍，檢測各個樣品的A值，根據(jù)標準曲線計算NGAL的實際濃度。

3.細胞培養(yǎng)及實驗分組：將HaCaT細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿瓶底后，以0.25%胰蛋白酶消化細胞，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，分別加入含0（對照組）、0.125、0.25、0.5、1 mg/L的NGAL［4］，培養(yǎng)12 h后收集細胞用于以下實驗。

4.Western印跡法檢測HaCaT細胞IL-22、TNF-α蛋白水平：取上述收集的細胞提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，取80 μg總蛋白樣品電泳、轉膜、封閉后，于4℃加入一抗（分別為IL-22抗體1∶1 000稀釋，TNF-α抗體1∶500，β肌動蛋白抗體1∶1 000）孵育過夜，加入二抗（山羊抗兔IgG抗體1∶500，馬抗小鼠IgG抗體1∶500）孵育2 h，加入顯色液，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，以IL-22、TNF-α條帶與β肌動蛋白的灰度值比值表示蛋白相對表達水平。

5.RT-PCR 檢測 HaCaT細胞 IL-22、TNF-α mRNA的表達：取上述收集的細胞提取總RNA，反轉錄合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IL-22基因正向引物5′-TATCACCA ACCGCACCTTC-3′，反向引物5′-CAGATTGAGGG AACAGCACTT -3′，擴增片段長度173 bp；TNF-α基因正向引物 5′-TCTGGGCAGGTCTACTTTGG -3′，反向引物5′-GGTTGAGGGTGTCTGAAGGA -3′，擴增片段長度116 bp；β肌動蛋白（內(nèi)參）正向引物5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，反向引物 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG -3′，擴增片段長度205 bp。PCR反應體系為25 μl，擴增條件：94 ℃預變性3 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)，72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，以IL-22、TNF-α條帶與β肌動蛋白的灰度值比值作為目的mRNA的相對表達水平。

6.統(tǒng)計學方法：采用SPSS 16.0軟件，計量資料以±s表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。相關性采用Spearman相關分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患兒治療前后PASI積分、中性粒細胞計數(shù)和NGAL的變化

治療2周后，銀屑病患兒PASI積分、中性粒細胞數(shù)（×109/L）和NGAL（μg/L）水平（1.80± 1.19、6.16±0.76、90.86±0.75）與治療前（10.38±3.42、11.01±2.85、113.48±21.26）相比均顯著下降（t=31.42、18.34、16.37，均P＜ 0.001）。相關性分析顯示，治療前患兒血清中NGAL水平與PASI積分、外周血中性細胞數(shù)呈正相關（rs=0.918、0.799，P＜0.05）。

二、NGAL對HaCaT細胞TNF-α、IL-22 mRNA及蛋白表達水平的影響

各濃度NGAL組HaCaT細胞間TNF-α、IL-22 mRNA水平差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），蛋白表達水平差異亦有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），0.125、0.25、0.5、1 mg/L NGAL組mRNA、蛋白表達水平均顯著高于對照組（均P＜0.05）。見表1，圖1、2。

表1 不同濃度中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白（NGAL）對HaCaT細胞腫瘤壞死因子α、白細胞介素22 mRNA及其蛋白表達的影響（±s）

注：n=5。a與對照組相比，P＜0.05

組別1 mg/L NGAL組0.5 mg/L NGAL組0.25 mg/L NGAL組0.125 mg/L NGAL組0（對照組）F值P值腫瘤壞死因子α mRNA 1.044±0.015a 0.729±0.096a 0.471±0.037a 0.385±0.017a 0.213±0.051 193.28＜0.001蛋白1.373±0.058a 0.982±0.051a 0.844±0.049a 0.687±0.030a 0.391±0.031 318.80＜0.001白細胞介素22 mRNA 1.151±0.103a 0.822±0.096a 0.386±0.071a 0.269±0.045a 0.088±0.007 176.31＜0.001蛋白1.185±0.028a 1.194±0.050a 1.020±0.046a 0.745±0.048a 0.434±0.034 296.96＜0.001

相關性分析顯示，TNF-α mRNA及蛋白表達水平與NGAL濃度呈正相關（rs=0.981、0.981，均P＜0.05）；IL-22 mRNA及蛋白的表達與NGAL濃度呈正相關（rs=0.973、0.934，均P＜ 0.05）。

討 論

銀屑病最具特征性的病理表現(xiàn)為中性粒細胞聚集。兒童銀屑病和感染的關系更為緊密，其中以急性點滴狀銀屑病患兒居多［5］。本研究入組的新發(fā)銀屑病患兒中性粒細胞水平明顯升高，34.7%的患兒伴發(fā)熱，66.3%的患兒有咽部紅腫或者扁桃體腫大等感染癥狀，進一步提示兒童銀屑病與感染可能存在密切的聯(lián)系。近年來有研究顯示，7NGAL在銀屑病皮損中的表達明顯升高［6-7］。本研究結果顯示，當銀屑病患兒發(fā)病時，外周血中性粒細胞增多同時伴外周血NGAL升高，經(jīng)過治療后，隨著皮損的好轉，患兒外周血中性粒細胞恢復正常，同時血清中NGAL水平會明顯下降。這提示，外周血NGAL可能參與中性粒細胞在外周血的增殖和趨化過程，從而可能影響銀屑病的皮損。本研究中兒童銀屑病在發(fā)病時皮損PASI積分、外周血中性粒細胞數(shù)量也與外周血中NGAL水平正相關。結合相關文獻，我們認為NGAL可能在感染誘發(fā)兒童銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

TNF-α是一類重要的炎癥細胞因子，由活化的巨噬細胞和T細胞產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)免疫應答和炎癥反應，抵御各種微生物感染，也是銀屑病發(fā)病核心致病因子之一，可通過多種方式直接或間接誘導銀屑病發(fā)生。前期研究［4］顯示，NGAL能刺激HaCaT細胞增殖。本研究顯示，NGAL可促進HaCaT細胞中TNF-α的表達，提示NGAL可能通過誘導TNF-α的表達在銀屑病發(fā)病機制中起重要作用。銀屑病是一種主要由T細胞介導的免疫性疾病，分泌IL-22的Th17、Th22細胞，在銀屑病皮損及外周血均可見升高［8］。IL-22可通過與IL-22受體1（IL-22R1）和IL-10R2組成的IL-22受體復合物產(chǎn)生效應。IL-22R1不表達于免疫細胞，只表達于特定器官的靶細胞，銀屑病中表達IL-22R1的角質(zhì)形成細胞是IL-22的主要靶細胞［9］。IL-22能直接作用于角質(zhì)形成細胞，發(fā)揮促增殖及抑制晚期分化作用，是免疫細胞和角質(zhì)形成細胞相互作用的橋梁分子。本研究提示，NGAL能刺激HaCaT細胞促進IL-22及其mRNA的表達，高劑量NGAL的刺激作用更為明顯。本研究中NGAL刺激后HaCaT細胞中TNF-α與IL-22的表達均增高，但后期是TNF-α還是TNF-α與IL-22協(xié)同促進HaCaT細胞增殖，還需進一步研究。

綜上，本研究顯示，NGAL在銀屑病患兒血清中高表達，且與患兒的皮損嚴重程度、外周血中性粒細胞計數(shù)呈正相關，NGAL能夠上調(diào)HaCaT細胞TNF-α、IL-22蛋白及mRNA的表達。提示銀屑病患兒在感染早期，中性粒細胞產(chǎn)生的NGAL能夠刺激中性粒細胞產(chǎn)生前炎癥刺激因子，誘導中性粒細胞遷徙，隨后加重炎癥反應并刺激細胞增殖，導致銀屑病形成。但NGAL在銀屑病的發(fā)病機制中，具體通過哪些途徑促進皮膚表皮細胞TNF-α、IL-22生成，還有哪些因子參與和維持NGAL持續(xù)放大性的炎癥反應過程，尚需進一步明確。