魚類抗菌肽研究進(jìn)展（一）

劉洪巖，薛暉，張世勇，王江，趙沐子，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

抗菌肽是一類廣泛存在于自然界中的高度保守的多肽，在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出廣譜抗菌活性?？咕淖钤缭趦蓷珓?dòng)物中發(fā)現(xiàn)，隨后在兔和人類中發(fā)現(xiàn)[1]。魚類中發(fā)現(xiàn)的最早的抗菌肽是1980年從美洲鰈中發(fā)現(xiàn)的，但直到1996年后才有突破性的進(jìn)展，目前魚類抗菌肽研究已取得與其他脊椎動(dòng)物物種相同的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了piscidin家族（魚類特有的抗菌肽，與天蠶抗菌肽同源），以及防御素、cathelicidin、hepcidin家族[2]。魚類的抗菌肽表現(xiàn)出許多與他脊椎動(dòng)物抗菌肽相同的特點(diǎn)，如廣譜的抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)功能。此外，魚類抗菌肽表現(xiàn)出獨(dú)特的適應(yīng)水生環(huán)境和微生物的特異性，因此，類抗菌肽在人類醫(yī)學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中都具有成為治療劑的潛力。

1 Piscidins

Piscidins是一類線性、兩親性抗菌肽，進(jìn)化上與兩棲類動(dòng)物和昆蟲抗菌肽相似[3]。在美洲擬鰈皮膚分泌物中發(fā)現(xiàn)的一種25個(gè)氨基酸的抗菌肽pleurocidian，是該家族發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成員。隨后，在其他相關(guān)物種中發(fā)現(xiàn)與pleurocidins同源的抗菌肽[4]。這些抗菌肽都是兩親性，類似于爪蟾抗菌肽天蠶素。在泥鰍中發(fā)現(xiàn)的piscidins被稱為misgurin[5]，在雜交條紋鱸[6]肥大細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的Piscidins稱為piscidian。其他類似的肽，包括 moronecidin，epinecidin，dicentracin，通過(guò)對(duì)其成熟肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)他們都屬于同一個(gè)進(jìn)化相關(guān)的家庭，因此將其稱為piscidins。

從氨基酸序列比對(duì)來(lái)看，piscidins家族有1個(gè)保守序列，也就是其雙親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)[3]。他們的基因由四個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，編碼1個(gè)含有1個(gè)信號(hào)肽肽前體，成熟肽和1個(gè)羧基末端結(jié)構(gòu)域[8]。

Piscidins主要在鰓、皮膚和腸表達(dá)，在頭腎和脾臟中有少量表達(dá)[9]。然而，大西洋鱈魚的軟骨、心臟、卵母細(xì)胞、外分泌和內(nèi)分泌腺體，魚鰾和其他組織中均有表達(dá)，不同的部位表達(dá)不同的亞型[10]。此外，表達(dá)piscidins的主要是存在于不同組織的的肥大細(xì)胞，小粒細(xì)胞，吞噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞[11]。粒細(xì)胞的吞噬體可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)分泌的piscidins殺傷細(xì)菌，這說(shuō)明Piscidins可以通過(guò)參與胞內(nèi)和胞外的免疫應(yīng)答來(lái)殺傷細(xì)菌[10]。此外，比目魚中，piscidins在孵化后13 d開始表達(dá)，說(shuō)明Piscidins在個(gè)體發(fā)育中起到重要作用[12]。

像哺乳動(dòng)物的抗菌肽基因一樣，各種刺激，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌，細(xì)菌細(xì)胞成分LPS[11]或細(xì)菌抗原ASAL[9]都會(huì)引起魚類抗菌肽基因的表達(dá)。LPS介導(dǎo)斑馬魚epinecidin-1基因表達(dá)，需要肝細(xì)胞核因子1的參與。此外，魚類的piscidins基因表達(dá)，可以由寄生蟲、病毒和聚肌胞引起[11]。另一項(xiàng)研究表明，高生物量密度作為一種急性應(yīng)激方式，會(huì)導(dǎo)致上調(diào)鰓和皮膚上調(diào)表達(dá)dicentracin[13]。

Piscidins具有廣譜的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有殺傷性，對(duì)幾種鏈球菌、假單胞菌、芽孢桿菌和弧菌都具有抗性。Piscidins也被證明具有抗真菌活性[6]，抗寄生蟲活性[11-12]和抗病毒活性。研究表明，piscidin-2是能夠有效抑制水霉[8]。

除了微生物，piscidins還具有介導(dǎo)或殺死腫瘤的活性，能夠被piscidins抑制的細(xì)胞系包括A549細(xì)胞系，HT1080 細(xì)胞、U937、HL60、U937、HeLa[14]以及不同乳腺癌細(xì)胞系[15]。此外，pleurocidin能夠通過(guò)損傷線粒體膜和釋放ROS殺死NOD SCID小鼠乳腺癌移植瘤[22]；piscidins還可以通過(guò)破壞癌細(xì)胞的細(xì)胞膜來(lái)殺死癌細(xì)胞[14]。

Piscidins通過(guò)細(xì)胞膜“打孔”的方式導(dǎo)致細(xì)胞物質(zhì)流出，人工膜模型證明，piscidins的膜定位能力，影響其裂解細(xì)胞的能力。此外，使用特定的高分辨率的固態(tài)NMR和圓二色譜結(jié)果表明，piscidin-1和-3誘導(dǎo)的膜與piscidins相互作用發(fā)生在模型表面的α-螺旋方向并且是平行面快速的、大幅度的骨干運(yùn)動(dòng)[16]。當(dāng)piscidins濃度低時(shí)，不會(huì)造成明顯的抑制與細(xì)胞膜損傷，但能夠抑制細(xì)菌大分子的合成。通過(guò)對(duì)原生質(zhì)體再生和細(xì)胞膜破壞，造成氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）釋放，激活metacaspases，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸外翻，從而引起真菌和白色念球菌凋亡[17]。

Piscidins的免疫調(diào)節(jié)能力是他的另外一個(gè)重要特性。在魚類中，它們能夠調(diào)節(jié)促炎和其他免疫相關(guān)基因的表達(dá)，如 IL-1β、IL-10、TNF-α、IL-22，IL-26，IFN-γ，NF-κB，溶菌酶，NOS2，MyD88，TLR4a，TLR1、TLR3。還有一些piscidins能夠刺激人體肥大細(xì)胞的趨化性增加，Ca2+動(dòng)員以及誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子（如CCL2，1β/CCL4）的產(chǎn)生，釋放白三烯和前列腺素D2[18]。

總體看來(lái)，piscidins是一種進(jìn)化上非常保守的抗菌肽家族，在魚類中表現(xiàn)出廣泛的同源性，并且在許多其他物種中也有同源抗菌肽種類存在。

2 β-防御素

β-防御素是一類富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，在植物、真菌、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)中都有發(fā)現(xiàn)，防御素具有保守的半胱氨酸構(gòu)成的穩(wěn)定螺旋和β-折疊。在哺乳動(dòng)物中，根據(jù)防御素的結(jié)構(gòu)可以分為三種，α-防御素，β-防御素，和θ防御素[19]。在魚類中，序列分析和結(jié)構(gòu)分析表明，魚類的防御素只有β-防御素樣蛋白[20]，含有保守的6-半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。到目前為止，在一個(gè)單一物種中發(fā)現(xiàn)過(guò)多達(dá)四個(gè)基因，這顯然是在脊椎動(dòng)物防御素基因復(fù)制的結(jié)果[22]。人類和魚類的防御素進(jìn)行進(jìn)化分析結(jié)果表明，人類防御素中僅有HBD-4能夠與魚類防御素聚為一支，因此魚類防御素可能與HBD-4具有相似的生物學(xué)特性[20]。

人防御素基因有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，防御素被翻譯后，即為成熟的抗菌肽[21]。在魚類中，防御素基因包含3個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白前體（包括信號(hào)肽、前肽和成熟肽），由60到77個(gè)氨基酸組成，成熟肽則是由38到45組成的陽(yáng)離子肽，等電點(diǎn)在8左右（除了牙鲆防御素，等電點(diǎn)是4左右，具有陰離子抗菌肽的性質(zhì)）。

魚β-防御素已被證明能有效對(duì)抗革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌，但是活性較弱，MIC值比較高。使用β-防御素轉(zhuǎn)染過(guò)的HEK293T細(xì)胞的裂解液，能夠顯著提高泥鰍或金頭鯛防御嗜水氣單胞菌和枯草桿菌的能力[23]。β-防御素對(duì)特定的病毒，如新加坡石斑魚虹彩病毒，病毒性神經(jīng)壞死病毒，出血性敗血癥病毒均表現(xiàn)出殺傷活性。有研究表明，人類-防御素-1（HD-1）是能夠使鮭魚彈狀病毒失活[24]。

除了其抗菌活性，防御素還具有多種免疫調(diào)節(jié)活性。例如，金頭鯛防御素具有趨化活性，能夠趨化斑馬魚頭腎白細(xì)胞，其作用機(jī)制可能是斑馬魚中有CCR6同源基因[25]。另外，大西洋鱈魚防御素能夠刺激吞噬細(xì)胞抗菌活性[26]。

只有少數(shù)防御素（主要是HBD-1及其同系物）是組成型表達(dá)的，大多數(shù)防御素表達(dá)是后天的，其表達(dá)可由多種因素引起的，其中包括許多先天免疫介質(zhì)和病原相關(guān)分子模式[27-29]。魚β-防御素基因通過(guò)各種刺激因子誘導(dǎo)表達(dá)，包括細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖，β-葡聚糖和肽聚糖。此外，作為飼料添加劑硅藻naviluca sp.和乳酸菌Lactobacillus sakei能夠誘導(dǎo)的金頭鯛β-防御素表達(dá)[30]。綜上所述，魚類防御素是哺乳動(dòng)物同源的、具有類似結(jié)構(gòu)和功能以及表達(dá)方式的多肽。這進(jìn)一步證明了β-防御素是一個(gè)高度保守的、古老的宿主防御機(jī)制。