基于高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定荔枝和香蕉中的草銨膦及3種代謝物

王思威, 曾廣豐, 劉艷萍, 王瀟楠, 孫海濱*

(1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640;2. 廣東省出入境檢疫檢驗(yàn)局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 廣東 廣州 510623)

草銨膦(glufosinate-ammonium, GA)是德國(guó)赫斯特公司開(kāi)發(fā)的廣譜、觸殺型滅生性有機(jī)磷類(lèi)除草劑,其除草作用機(jī)理為特異性地抑制植物的谷氨酰胺合成酶活性,導(dǎo)致植物體內(nèi)氮代謝紊亂,過(guò)量累積銨,從而使葉綠體解體、光合作用受到抑制導(dǎo)致死亡[1,2]。由于雜草對(duì)草銨膦不易產(chǎn)生抗藥性,這促使草銨膦的銷(xiāo)售量激增。草銨膦的主要代謝產(chǎn)物為3-(甲基膦基)丙酸(3-methylphosphinico-propionic acid, MPP)、2-(甲基膦基)乙酸(2-methylphosphinico-acetic acid, MPA)和N-乙酰草銨磷(N-acetyl-glufosinate, NAG)(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)。已有研究表明草銨膦在急性劑量水平下可對(duì)人體產(chǎn)生有害影響[3],低劑量水平下對(duì)人體的慢性影響暫不清楚[4];草銨膦對(duì)人體的生殖系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生毒性,其代謝產(chǎn)物也為有毒物質(zhì),對(duì)人類(lèi)健康存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性[5,6]; JMPR(Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues)報(bào)告中顯示,山羊、蛋雞飼喂含草銨膦的飼料后,在羊奶、雞蛋、組織和排泄物中的主要?dú)埩舫煞譃椴蒌@膦游離酸(glufosinate), glufosinate再代謝為MPP和少量的NAG、MPA[7]。因此,開(kāi)展草銨膦及代謝產(chǎn)物在不同基質(zhì)中的分析方法研究十分必要。

圖 1 草銨膦及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of glufosinate-ammonium and its metabolites

目前,關(guān)于草銨膦的研究仍主要集中于母體[8-16],其代謝產(chǎn)物MPP和NAG的分析方法較少[6],暫未發(fā)現(xiàn)MPA的相關(guān)報(bào)道。

由于草銨膦及其代謝物具有低揮發(fā)性、高水溶性、缺乏紫外生色團(tuán)以及結(jié)構(gòu)上存在陰離子等特性,故氣相色譜和液相色譜很難直接檢測(cè)[16]。Royer等[17]通過(guò)預(yù)先采用三氟乙酸酐等作為衍生劑將草銨膦衍生,然后采用GC-MS檢測(cè);See等[18]采用在線(xiàn)毛細(xì)管電泳結(jié)合電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)草銨膦;Chang等[19]首先用9-芴基氯甲酸甲酯對(duì)草銨膦進(jìn)行柱前衍生,毛細(xì)管電泳分離,紫外檢測(cè)器檢測(cè)草銨膦衍生物;Kusters和Gerhartz[20]采用液相色譜-熒光檢測(cè)器用9-芴基氯甲酸甲酯對(duì)草銨膦進(jìn)行柱前衍生后測(cè)定草銨膦殘留。國(guó)內(nèi)有關(guān)草銨膦母體的分析方法主要為固相萃取小柱凈化-衍生-HPLC(UPLC)-MS/MS檢測(cè),過(guò)濾柱凈化-離子色譜(IC)檢測(cè),固相萃取小柱凈化-毛細(xì)管電泳(CE)紫外檢測(cè)法等,代謝物MPP和NAG主要采用堿液提取后HPLC-MS/MS直接進(jìn)樣分析,其中MPP采用毛細(xì)管電泳-紫外檢測(cè)結(jié)合固相萃取小柱進(jìn)行分析[8-16]。

歐盟規(guī)定草銨膦的殘留定義為glufosinate及其鹽、MPP和NAG之和;日本對(duì)glufosinate的殘留定義為glufosinate、MPP和NAG之和;CAC(Codex Alimentarius Commission)規(guī)定草銨膦殘留定義為草銨膦、MPP和NAG之和;中國(guó)GB 2763-2016上規(guī)定草銨膦的殘留定義僅為草銨膦。歐盟、日本和CAC規(guī)定草銨膦在荔枝、香蕉、芒果等水果中的最大殘留限量值(MRLs)為0.1～0.2 mg/kg[21-23],我國(guó)僅規(guī)定了草銨膦在香蕉、柑橘和番木瓜3種水果中的MRLs值(0.2～0.5 mg/kg),且均為臨時(shí)限量[24]。因此,通過(guò)建立草銨膦及其3種代謝物在水果中的分析方法,可為草銨膦在上述水果中的殘留試驗(yàn)提供方法參考,為殘留限量的制定提供保障,同時(shí)為市場(chǎng)上草銨膦及代謝物的殘留水平監(jiān)測(cè)提供方法依托。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX 4000Q三重四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源(ESI)(美國(guó)AB SCIEX公司); Agilent LC-1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司); Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司); GTR22-1離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司); OA-SYS氮吹儀(美國(guó)); XW-80A渦旋儀(上海精科有限公司)。

乙腈和甲醇(色譜純,美國(guó)Fisher公司);甲酸和氨水(色譜純,美國(guó)Fluka公司);草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品(99.2%,德國(guó)Ehrenstorfer公司); MPP、MPA、NAG標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.9%、99.4%、96.2%,德國(guó)Ehrenstorfer公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理

分別稱(chēng)取荔枝和香蕉樣品5.0 g,置入50 mL離心管中,加入10 mL水進(jìn)行提取,勻漿1 min,超聲30 min后,10 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45 ℃濃縮至約50 μL,氮吹至近干,用含0.1%(v/v)氨水的甲醇定容至1 mL,過(guò)0.22 μm濾膜,待測(cè)。

1.2.2色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件 色譜柱為Agilent Extend-C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm);流動(dòng)相為0.1%(v/v)氨水-甲醇(9∶1, v/v),運(yùn)行5 min;流速0.5 mL/min;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件 ESI-,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,離子源溫度450 ℃,氣簾氣壓力206.85 kPa(30 psi),毛細(xì)管電壓4 500 V,霧化氣壓力344.75 kPa(50 psi)。其他相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 草銨膦及3種代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of GA and its three metabolites

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

由于草銨膦及其代謝物均為水溶性,因此考察了1%(v/v,下同)甲酸甲醇-水(2∶1, v/v)、1%甲酸水溶液和水3種提取劑時(shí)對(duì)草銨膦及其3種代謝物的提取效率。結(jié)果顯示,1%甲酸甲醇-水(2∶1, v/v)和1%甲酸水溶液作為提取溶劑時(shí)草銨膦及其代謝物的提取率均在40%以下,而水作為提取溶劑的提取率均在80%以上。因此,本研究選擇水作為提取溶劑(見(jiàn)圖2)。

圖 2 3種提取溶劑對(duì)草銨膦及其代謝物的提取效果(n=3)Fig. 2 Extraction efficiencies of three solvents for GA and its metabolites (n=3)

2.2 儀器條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

考察了Poroshell-120 EC-C18(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm)、Poroshell-120 EC-C18(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)、XBridge C18(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)、Atlantis T3(100 mm×3.0 mm, 3.0 μm)、Extend C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)等5種色譜柱在不同流動(dòng)相體系(乙腈-甲酸水和乙腈-氨水)下對(duì)4種目標(biāo)物的分離能力。如圖3所示:5種色譜柱在乙腈-0.1%甲酸水等度洗脫流動(dòng)相體系(1∶9, v/v)的峰形對(duì)稱(chēng)性差,色譜峰拖尾嚴(yán)重,可能由于目標(biāo)物酸性太強(qiáng),在酸性流動(dòng)相體系中與色譜柱作用力太強(qiáng)所致。因此改用氨水體系作為流動(dòng)相。在堿性流動(dòng)相體系下,上述5款色譜柱中,只有Extend C18(150 mm×3.0 mm, 3.5 μm)的固定相能耐受堿性流動(dòng)相,且草銨膦及3種代謝物的峰形對(duì)稱(chēng)性和響應(yīng)均良好,可用于本研究檢測(cè)分析。

圖 3 5種不同色譜柱對(duì)草銨膦及代謝物的色譜分離圖Fig. 3 Chromatograms of GA and its metabolites on five different chromatographic columns Mobile phase: 0.1% formic acid aqueous solution-acetonitrile (9∶1, v/v).

圖 4 采用不同流動(dòng)相時(shí)草銨膦及代謝物的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of GA and its metabolites with different mobile phases

2.2.2流動(dòng)相的選擇

考察了乙腈和甲醇兩種有機(jī)相分別與氨水組合形成的流動(dòng)相體系對(duì)草銨膦及3種代謝物的洗脫效果。結(jié)果如圖4所示:有機(jī)相選用乙腈時(shí),4種目標(biāo)物的峰形出現(xiàn)峰展寬、不對(duì)稱(chēng)等現(xiàn)象,影響定量分析結(jié)果。使用甲醇-氨水作為流動(dòng)相時(shí),氨水的加入可使目標(biāo)物峰形對(duì)稱(chēng)和峰寬更窄,并促成[M-H]-離子峰的形成,以[M-H]-作為母離子能夠獲取高強(qiáng)度的離子碎片,增強(qiáng)草銨膦及3種代謝物的響應(yīng)值,提高檢測(cè)分析的靈敏度。草銨膦是一種含有氨基的堿性農(nóng)藥,其他3種代謝物含有-COOH或-POOH基團(tuán),均具有較強(qiáng)的水溶性,需要流動(dòng)相中水的含量較高,參考文獻(xiàn)[6,11]選擇流動(dòng)相為0.1%氨水-甲醇(9∶1, v/v),能夠保證草銨膦和3種代謝物的高響應(yīng)值。因此,本研究選擇0.1%氨水-甲醇(9∶1, v/v)作為流動(dòng)相。

2.2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用正負(fù)離子掃描模式對(duì)4種目標(biāo)物進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在ESI負(fù)離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度更高,分子離子峰均為[M-H]-形式。因此,在負(fù)離子掃描模式下確定了草銨膦及MPP、MPA和NAG的母離子分別為m/z180.0、150.9、136.9、222.0。為提高目標(biāo)化合物的離子化效率,進(jìn)而提高靈敏度,對(duì)源內(nèi)參數(shù)(去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等)進(jìn)行了優(yōu)化。采用針泵進(jìn)樣的方式,優(yōu)化去簇電壓,在二級(jí)質(zhì)譜中選擇母離子響應(yīng)強(qiáng)度最高、干擾最少的2個(gè)子離子作為定性和定量離子;在MRM模式下,對(duì)子離子的CE進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

考察了草銨膦及3種代謝物在純?nèi)軇┘袄笾?、香蕉基質(zhì)中的響應(yīng)情況。用0.1%氨水-甲醇(9∶1, v/v)溶液配制草銨膦及代謝物的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,同時(shí),按照1.2.1的前處理方法,制備空白荔枝和香蕉基質(zhì)溶液,用來(lái)配制與上述溶劑同濃度水平的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率與溶劑曲線(xiàn)斜率的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng),比值大于1,表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),比值小于1則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,荔枝和香蕉樣品均表現(xiàn)為強(qiáng)烈的基質(zhì)抑制作用(見(jiàn)表2)。因此,本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)校正基質(zhì)抑制效應(yīng),從而確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.4 方法的線(xiàn)性范圍及檢出限

在1～1 000 μg/L范圍內(nèi),以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)作圖,經(jīng)最小二乘法得草銨膦、MPA、MPP及NAG基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液線(xiàn)性方程(見(jiàn)表2),結(jié)果表明,線(xiàn)性關(guān)系良好。

以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 草銨膦及其代謝物的溶劑、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、斜率比值、檢出限及定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and slope ratios, limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs) of GA and its metabolites in the solvent and matrices

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.5 回收率試驗(yàn)

對(duì)市場(chǎng)上抽測(cè)的5個(gè)荔枝和香蕉樣品進(jìn)行檢測(cè),均未檢出草銨膦及其代謝物。在50、100、1 000 μg/kg 3個(gè)添加水平下,草銨膦及3種代謝物在荔枝和香蕉中的平均添加回收率為82.9%～98.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%～6.3%(見(jiàn)表3和圖5)。方法的回收率和RSD范圍符合殘留分析檢測(cè)要求[25]。

表 3 草銨膦及代謝物在荔枝、香蕉樣品中的添加回收率和RSD(n=5)Table 3 Recoveries and RSDs of GA and its metabolites spiked in litchi and banana (n=5)

圖 5 草銨膦和3種代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液、荔枝和香蕉空白樣品及加標(biāo)(100 μg/kg)樣品的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of a mixture of GA and its metabolite standards, blank and spiked samples of litchi and banana (100 μg/kg)

3 結(jié)論

本文建立了應(yīng)用HPLC-MS/MS方法檢測(cè)荔枝和香蕉中草銨膦及3種代謝物殘留水平的分析方法,前處理方法操作簡(jiǎn)便、快速,儀器靈敏度高,適于批量樣品的快速分析,可應(yīng)用于市場(chǎng)抽檢樣品中草銨膦及其代謝物的快速監(jiān)測(cè)。