高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹(shù)膠中的酚類化合物及真?zhèn)舞b別

陳 磊, 劉 蕓, 陳 雷, 張曉燕, 馮 峰, 張 峰

(1. 南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 江蘇 南京 210019;2. 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176)

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和樹(shù)干處采集的樹(shù)脂混入蜜蜂上顎腺和蜂蠟等物質(zhì)形成的一種具有芳香氣味的黏性膠狀固形物[1],其作為蜜蜂生存環(huán)境的天然屏障,可以有效維持整個(gè)蜂群的健康。一個(gè)5～6萬(wàn)只的蜂群一年只能生產(chǎn)蜂膠70～110 g,蜂膠被譽(yù)為“紫色黃金”。由此可見(jiàn),蜂膠的實(shí)際產(chǎn)量并不大,但目前我國(guó)市場(chǎng)上的蜂膠類產(chǎn)品卻種類繁多,其中不乏楊樹(shù)膠制成的偽品。因此,對(duì)蜂膠進(jìn)行可靠的質(zhì)量控制非常重要。我國(guó)目前實(shí)施的蜂膠國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 24283-2009)中規(guī)定的感官指標(biāo)包括結(jié)構(gòu)、色澤、狀態(tài)、氣味和滋味,理化指標(biāo)包括乙醇提取物含量、總黃酮和氧化時(shí)間。在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),這些指標(biāo)均不能有效區(qū)分蜂膠與楊樹(shù)膠,因?yàn)闂顦?shù)膠也可以達(dá)到檢測(cè)要求。目前用于產(chǎn)地為中國(guó)的蜂膠摻假鑒別的國(guó)標(biāo)方法為GB/T 34782-2017。該方法利用高效液相色譜法檢測(cè)水楊苷和鄰苯二酚,對(duì)蜂膠和楊樹(shù)膠進(jìn)行鑒別。此外,還有基于高效液相色譜指紋圖譜法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(GH/T 1087-2013)也能用于蜂膠摻假鑒別。但總的來(lái)說(shuō),蜂膠摻假的鑒別方法仍然偏少,不足以遏制目前的蜂膠摻假現(xiàn)象。

蜂膠的質(zhì)量取決于其中所含有效活性物質(zhì)的量。蜂膠中含有許多黃酮類、酚酸及其酯類、萜類和有機(jī)酸類物質(zhì)[2-4]。其中,黃酮類與酚酸及其酯類同屬酚類化合物,是蜂膠療效的最主要來(lái)源[5]。已有大量文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道,蜂膠中的這些生物活性物質(zhì)顯示出廣譜抗菌、抗腫瘤、殺菌,局部麻醉、抗炎、降低血壓、受激免疫及抑制細(xì)胞、穩(wěn)定細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞組織再生的生理活性。由于蜂膠含有的化學(xué)成分受植物來(lái)源影響比較大,所以在世界范圍內(nèi),不同地區(qū)蜂膠的化學(xué)成分也存在較大差異[10]。周夢(mèng)瑤等[11]根據(jù)地域?qū)κ澜缰饕淠z的植物來(lái)源及其化合物組成進(jìn)行了綜述。張翠平等[12]根據(jù)植物來(lái)源將世界范圍內(nèi)的蜂膠分為楊樹(shù)屬型、酒神菊屬型、克魯西屬型、血桐屬型和地中海東部地區(qū)型5大類。其中,楊樹(shù)屬型蜂膠(例如中國(guó)蜂膠)和酒神菊屬型蜂膠(俗稱巴西綠蜂膠)被研究和報(bào)道的比較廣泛和深入。

本文選取酚類化合物為研究對(duì)象,以高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜為研究手段,通過(guò)測(cè)定中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、巴西綠蜂膠、楊樹(shù)膠中的主要酚類化合物,進(jìn)行定量檢測(cè)和差異性分析,篩選能用于辨別中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠真?zhèn)巍^(qū)別中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠和巴西綠蜂膠的特征標(biāo)志物,以改善現(xiàn)有的蜂膠質(zhì)控方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260液相色譜儀串聯(lián)6530飛行時(shí)間質(zhì)譜,配有自動(dòng)脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)Agilent公司); PURELAB Option Q5超純水制備儀(英國(guó)ELGA公司); KH-500B型超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、楊樹(shù)膠樣品采集自山東、湖北、河南、江蘇等地,巴西綠蜂膠為進(jìn)出口企業(yè)送檢樣品。為保證樣品的含膠量一致,所選蜂膠及樹(shù)膠樣品均為乙醇提取物。

咖啡酸、白楊素、松屬素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水楊苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、異鼠李素、鼠李素、楊梅酮、桔皮素、蘆丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海安譜化學(xué)試劑有限公司,純度均不小于99.5%;乙腈和甲醇(均為色譜純,德國(guó)Merck公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg咖啡酸、白楊素、松屬素、刺芒柄花素、芹菜素、高良姜素、柚皮素、芫花素、咖啡酸苯乙酯、山柰酚、木犀草素、水楊苷、山柰素、阿替匹林C、槲皮素、異鼠李素、鼠李素、楊梅酮、桔皮素、蘆丁、香豆酸、肉桂酸以及阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇定容至10 mL,得到1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。臨用前用甲醇逐級(jí)稀釋至適當(dāng)濃度。

圖 1 23種酚類化合物(200 μg/L)的提取離子色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the 23 phenolic compounds (200 μg/L)

1.3 樣品前處理

稱取約0.2 g樣品,加入適量甲醇,超聲約15 min至完全溶解后,用甲醇定容至50 mL。取500 μL上述甲醇溶液至1.5 mL塑料離心管中,加超純水500 μL,渦旋混勻后以12 000 r/min的速度離心3 min,上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜后進(jìn)樣。由于樣品中有些化合物含量非常高,用甲醇-水(1∶1, v/v)分別稀釋10、100和1 000倍后再次進(jìn)樣。

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流速:200 μL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:A相為乙腈,B相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 30%A; 1.0～5.5 min, 30%A～55%A; 5.5～15.0 min, 55%A～70%A; 15.0～16.0 min, 70%A～30%A; 16.0～20.0 min, 30%A。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子(ESI)源;檢測(cè)模式:正離子;干燥氣流速:5 L/min;干燥氣溫度:325 ℃;霧化氣壓力:310 kPa;鞘氣溫度:400 ℃;鞘氣流速:12.0 L/min,離子掃描范圍:m/z100～1 000。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0軟件(美國(guó)SPSS公司)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(95%置信區(qū)間),分別比較中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠與巴西綠蜂膠,中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠與楊樹(shù)膠之間23種酚類化合物的含量差異,篩選特征化合物。

圖 1 (續(xù))Fig. 1 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 線性范圍、檢出限與定量限

分別取適量23種化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇-水(1∶1, v/v)逐級(jí)稀釋至200、100、50、20、10 μg/L。按照上述儀器條件檢測(cè)后,以化合物的峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X(μg/L)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算得到23種化合物的校正曲線方程。23種酚類化合物在10～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。桔皮素和刺芒柄花素的檢出限和定量限分別為0.2和1 μg/L,其他化合物的檢出限和定量限分別為2和10 μg/L。23種酚類化合物的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 精密度和回收率

在10、25和50 mg/kg 3個(gè)添加水平下,分別考察23種酚類化合物在中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹(shù)膠中的提取回收率。每個(gè)添加水平分別重復(fù)3次試驗(yàn),結(jié)果如表1所示,23種酚類化合物在3種

樣品基質(zhì)中的提取回收率為70.2%～122.6%, RSD值均小于10%,滿足定量分析方法的要求。

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本文建立的檢測(cè)方法對(duì)10個(gè)中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、8個(gè)巴西蜂膠和10個(gè)楊樹(shù)膠中23種酚類化合物的含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。楊樹(shù)膠中阿魏酸、肉桂酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素的含量比較高。中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素含量比較高。巴西蜂膠中香豆酸、異鼠李素、山柰素、阿替匹林C含量比較高。3種樣品中均沒(méi)有檢測(cè)到蘆丁、楊梅酮、刺芒柄花素和桔皮素。

表 1 23種酚類化合物在中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹(shù)膠中的回收率和精密度(n=3)Table 1 Recoveries and precisions of the 23 phenolic compounds in Chinese poplar propolis, Brazil green propolis, and poplar gum (n=3)

表 2 楊樹(shù)膠(n=10)、中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠(n=10)和巴西綠蜂膠(n=8)中23種酚類化合物的含量Table 2 Contents of the 23 phenolic compounds in poplar gum (n=10), Chinese poplar propolis (n=10), and Brazil green propolis (n=8)

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中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠和楊樹(shù)膠的主要植物來(lái)源都是楊樹(shù),檢測(cè)結(jié)果顯示這兩組樣品中白楊素、松屬素、高良姜素含量都非常高,與文獻(xiàn)結(jié)論一致[10-12]。另外,這兩組樣品中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯的含量也都很高。已有較多文獻(xiàn)[13-17]報(bào)道中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠中這兩種化合物的含量較高。但是由于楊樹(shù)膠的相關(guān)研究較少,這兩種化合物在楊樹(shù)膠中的含量情況目前還存在疑問(wèn)。如曹煒等[18]報(bào)道,楊樹(shù)芽提取物中阿魏酸和咖啡酸苯乙酯都有檢出,而Zhang等[19]報(bào)道楊樹(shù)膠中未檢出阿魏酸。

正是由于楊樹(shù)膠和中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠的化合物組成存在諸多的相似性,所以楊樹(shù)膠經(jīng)常用于中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠的摻假。根據(jù)本文的檢測(cè)結(jié)果,兩者也有許多化合物的含量存在明顯的差異,可以用于中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠摻假鑒別。例如水楊苷和肉桂酸,在楊樹(shù)膠中的含量遠(yuǎn)高于中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠(P<0.05),可以作為楊樹(shù)膠的特征化合物;反之,咖啡酸和香豆酸在中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠中的含量遠(yuǎn)高于楊樹(shù)膠(P<0.05),可以作為中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠的特征化合物。在進(jìn)行中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠的摻假鑒別時(shí),綜合考察楊樹(shù)膠和中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠兩方面的特征化合物所得出的判定結(jié)論將會(huì)更加準(zhǔn)確。其中,水楊苷、咖啡酸、香豆酸用于中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠的摻假鑒別已有文獻(xiàn)[19,20]報(bào)道,肉桂酸在中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠和楊樹(shù)膠中的含量差異尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

巴西蜂膠的主要植物來(lái)源為酒神菊樹(shù),其化合物組成與中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠存在較大的差異。檢測(cè)結(jié)果顯示,中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠中咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素的含量遠(yuǎn)高于巴西蜂膠(P<0.05),可以作為中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠的特征化 合物。而巴西蜂膠中香豆酸、異鼠李素、山柰素和阿替匹林C的含量遠(yuǎn)高于中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠(P<0.05),可以作為巴西蜂膠的特征化合物。其中,阿替匹林C作為巴西綠蜂膠的特有化合物已經(jīng)有較多文獻(xiàn)[21,22]報(bào)道,而香豆酸、異鼠李素和山柰素在巴西綠蜂膠中的含量情況文獻(xiàn)報(bào)道較少[23]。

對(duì)于蜂膠中是否存在蘆丁,一直存在較大爭(zhēng)議。在早期的文獻(xiàn)和蜂膠標(biāo)準(zhǔn)[24-26]中,認(rèn)為蜂膠中存在一定含量的蘆丁。但是近來(lái)有越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道[18,19,27]蜂膠中并沒(méi)有檢測(cè)到蘆丁。因?yàn)槊鄯湓诓杉淠z時(shí),唾液中含有的β-糖苷酶能水解連接在苷元上的糖配基[28]。因此,蜂膠中不含有蘆丁應(yīng)該是比較可靠的結(jié)論。

3 結(jié)論

本文建立了一種同時(shí)檢測(cè)中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠、巴西綠蜂膠和楊樹(shù)膠中23種酚類化合物的高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜方法,該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠。此外,通過(guò)檢測(cè)實(shí)際樣品中23種酚類化合物的含量并進(jìn)行差異性分析,提出水楊苷、肉桂酸、咖啡酸和香豆酸可以作為中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠摻假鑒別的特征化合物,而咖啡酸、阿魏酸、白楊素、咖啡酸苯乙酯、松屬素、高良姜素、香豆酸、異鼠李素、山柰素和阿替匹林C可以作為辨別中國(guó)楊樹(shù)型蜂膠和巴西蜂膠的特征化合物。