楊桃根提取物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的預(yù)防作用

黃 湘，謝秋巧，葉芳杏，覃陸慧，黃仁彬，張士軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

肝臟是人體最重要的消化器官之一，關(guān)系著人體的健康。急性肝損傷是常見的肝臟疾病之一，其病因復(fù)雜，病情緊急。目前臨床醫(yī)治方法不斷進(jìn)步及完善，但其治療方法主要是對(duì)癥治療，尚無(wú)根治方法。急性肝損傷的預(yù)防及治療仍面臨嚴(yán)峻的形勢(shì)。因此，研究開發(fā)療效肯定的保肝藥物成為醫(yī)藥工作者的共識(shí)。

楊桃(AverrhoacarambolaL.)為醡漿草科多年生植物，主要入藥部位為根。研究表明，楊桃根提取物(extract ofAverrhoacarambolaL. root，EACR)及其單體化合物2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-環(huán)己二酮(2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione)對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥[1-2]、乳腺癌[3]等多種疾病具有療效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EACR對(duì)糖尿病引起的肝糖代謝紊亂具有明顯療效。因此我們推測(cè)，EACR對(duì)其他因素引起的肝損傷可能具有療效，并且尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在初步探討EACR對(duì)四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑昆明種小鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK桂2014-0003。動(dòng)物飼養(yǎng)于通風(fēng)良好環(huán)境中，溫度(18～25) ℃，相對(duì)濕度40%-70%，12 h光照晝夜循環(huán)。EACR的提取過(guò)程如下：5 kg楊桃根藥材經(jīng)80%乙醇浸泡提取3次(第1次2 h,第2次和第3次各1.5 h)，濃縮干燥后得到500 g干膏，低溫冷藏保存，臨用時(shí)用雙蒸水稀釋成所需濃度。CCl4(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)；聯(lián)苯雙酯滴丸(北京協(xié)和藥廠)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase , SOD)、丙二醛(malondialehyde, MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione , GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、總蛋白定量測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白細(xì)胞介素1(interleukin-1, IL-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)、caspase-3抗體(Cell Signaling Technology)。

1.2儀器SpectraMaxPlus384連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；5810R高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Sagecreation公司)；BX53顯微鏡(Olympus公司)。

1.3動(dòng)物分組、給藥方法及模型建立取60只♂小鼠，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(生理鹽水，20 mL·kg-1)、模型組(生理鹽水，20 mL·kg-1)、陽(yáng)性對(duì)照組(聯(lián)苯雙酯滴丸，0.02 g·kg-1)、EACR高劑量組(1.2 g·kg-1，相當(dāng)于12 g生藥·kg-1)、EACR中劑量組(0.6 g·kg-1，相當(dāng)于6 g生藥·kg-1)、EACR低劑量組(0.3 g·kg-1，相當(dāng)于3 g生藥·kg-1)，每組10只。預(yù)防性提前給予相應(yīng)藥物7 d，1 d 1次。末次給藥后1 h，正常組注射等劑量橄欖油，其他各組小鼠腹腔注射0.15% CCl4橄欖油(10 mL·kg-1，均一次性注射)，建立急性肝損傷模型。

1.4標(biāo)本采集采用4%水合氯醛麻醉小鼠后，頸椎脫臼處死小鼠，摘除眼球采血，離心后收集上層血清。剖腹取其肝臟，PBS沖洗干凈后，拭干，稱重，存放于液氮中，備用。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 小鼠麻醉后，摘除眼球采血，4 ℃、3 500 r·min-1離心10 min，收集上層血清。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清ALT、AST、IL-1、IL-6。

1.5.2肝臟組織指標(biāo)的測(cè)定 取適量肝組織，洗去積血后，按1 ∶9加入生理鹽水制備成10%的肝組織勻漿。按照試劑盒的說(shuō)明測(cè)定SOD、MDA、GSH、GSH-Px及蛋白的含量。另取約0.1 g肝臟組織，加入10倍量的RIPA裂解液，提取蛋白。采用Western blot法檢測(cè)肝臟組織中的TNF-α、NF-κB、caspase-3的蛋白表達(dá)水平。

1.5.3肝組織病理學(xué)檢查 肝組織經(jīng)10%甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1小鼠的一般情況小鼠飼養(yǎng)期間，體質(zhì)量均有所增加，但各組間差異無(wú)顯著性。建立急性肝損傷模型后，與正常組相比，模型小鼠出現(xiàn)狂躁，繼而精神萎蔫，反應(yīng)遲鈍，毛色暗淡。與模型小鼠相比，EACR 3個(gè)劑量組小鼠的行為、精神及外觀等一般狀態(tài)均有所改善。

2.2EACR對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響由Tab 1可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，EACR高、中劑量組肝臟指數(shù)明顯降低(P<0.05或P<0.01)，EACR低劑量組差異無(wú)顯著性。

Tab 1 Effects of EACR on liver index in n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.3EACR對(duì)小鼠肝臟病理學(xué)變化的影響Fig 1肝臟病理染色結(jié)果表明，正常組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，核大而圓，肝索呈星狀排列，肝間質(zhì)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肝細(xì)胞變性，部分胞質(zhì)崩解，肝索邊界模糊，肝小葉中央?yún)^(qū)及周邊可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，局部壞死。EACR低劑量組肝細(xì)胞核固縮，肝索排列紊亂，肝間質(zhì)間有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少部分出現(xiàn)壞死。EACR高、中劑量組及陽(yáng)性組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較清晰，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索排列較整齊，未見明顯充血。

Fig 1 HE staining of liver tissues (×200)

A：Normal；B：Model；C：Positive control；D：EACR high dose group；E：EACR middle dose group；F：EACR low dose group.

2.4EACR對(duì)小鼠血清AST、ALT、IL-1、IL-6的影響由Tab 2可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的AST、ALT、IL-1、IL-6明顯升高(P<0.01)。與模型組小鼠相比，EACR 3個(gè)劑量組小鼠的AST、ALT、IL-1、IL-6水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5EACR對(duì)小鼠肝臟組織SOD、MDA、GSH、GSH-Px的影響由Tab 3可知，與正常組小鼠比較，模型組小鼠的SOD、GSH、GSH-Px明顯降低(P<0.01)，MDA明顯升高(P<0.01)；與模型組小鼠相比，EACR能夠明顯提高小鼠肝臟SOD、GSH、GSH-Px活性，明顯下調(diào)MDA水平(P<0.05或P<0.01)，EACR低劑量組的GSH雖然有所升高，但差異無(wú)顯著性。

2.6EACR對(duì)小鼠肝臟中TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟中的TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，EACR 3個(gè)劑量組小鼠的TNF-α、NF-κB、caspase-3蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

3 討論

CCl4是親肝毒物，被認(rèn)為是化學(xué)性肝損傷模型的經(jīng)典誘導(dǎo)劑[4]?；瘜W(xué)性肝損傷是保肝藥物篩查常用的模型[5]。正常情況下，AST、ALT主要存在于胞質(zhì)內(nèi)，極少存在于血清中。CCl4進(jìn)入機(jī)體后，在肝微粒體酶的作用下代謝為三氯甲基，三氯甲基可破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加肝細(xì)胞膜的通透性[6]，導(dǎo)致胞內(nèi)酶AST、ALT從胞內(nèi)大量釋放到血液中，引起血液中的AST、ALT升高。因此，血清中的AST、ALT可以直接反映肝臟的損傷程度[7]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠的AST、ALT明顯升高，說(shuō)明造模成功。聯(lián)苯雙脂滴丸陽(yáng)性對(duì)照組及EACR各給藥組的AST、ALT明顯降低，說(shuō)明預(yù)防性給予EACR能減輕CCl4對(duì)小鼠肝臟造成的損傷。CCl4在體內(nèi)經(jīng)過(guò)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基可攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[8]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物之一，在CCl4誘導(dǎo)肝損傷的過(guò)程中逐漸積累，并與生物大分子結(jié)合成醛，進(jìn)一步破壞肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[9]。SOD作為有效的金屬酶，能夠催化超氧化物陰離子歧化為H2O2和O2。GSH-Px催化毒性過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，同時(shí)還能將H2O2和氫過(guò)氧化物還原成水，從細(xì)胞膜上除去脂質(zhì)過(guò)氧化氫，從而終止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[10]。GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化劑，能與細(xì)胞色素P450的代謝產(chǎn)物結(jié)合，達(dá)到清除自由基的作用，進(jìn)而保護(hù)肝臟。本研究結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組及EACR 3個(gè)給藥組能有效降低MDA水平，提高SOD、GSH、GSH-Px的水平，表明EACR的保肝作用可能與其參與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

Fig 2 Effects of EACR on expressions of TNF-α, NF-κB and caspase-3 in liver tissues of n=4)

1：Normal；2：Model；3：Positive control；4：EACR high dose group；5：EACR middle dose group；6：EACR low dose group.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

Tab 2 Effects of EACR on levels of AST, ALT, IL-1 and IL-6 in serum of n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 3 Effects of EACR on levels of SOD, MDA, GSH and GSH-Px in tissues of n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

研究表明，細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)可能參與CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷。IL-1、IL-6通常被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物。CCl4進(jìn)入機(jī)體后，刺激枯否細(xì)胞分泌IL-1、IL-6，使得IL-1、IL-6的分泌增加，加速炎癥反應(yīng)[11]。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌的內(nèi)源性細(xì)胞因子，它通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的通路以調(diào)節(jié)炎癥因子和細(xì)胞增殖，加速炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[12]。NF-κB參與調(diào)控炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，抑制其表達(dá)能夠抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)行[13]。凋亡是由多個(gè)基因控制的細(xì)胞生理自我滅亡的過(guò)程[14]。caspase-3是caspase家族中一種重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的中心效應(yīng)物，它能在裂開它的基底物的同時(shí)改變細(xì)胞的形態(tài)及生化特性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組及EACR各給藥組能降低IL-1、IL-6的水平，下調(diào)TNF-α、NF-κB、caspase-3的蛋白表達(dá)。表明EACR的保肝作用可能與其參與抑制炎癥因子有關(guān)。

綜上所述，EACR通過(guò)清除氧自由基及抑制炎癥因子釋放，從而減輕CCl4對(duì)小鼠肝臟的損害。