揚州市結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因突變分析

戴潔 曾方林 王金富（通訊作者）,2

（1 揚州市第三人民醫(yī)院 江蘇 揚州 225025）

（2 揚州大學人獸共患病學重點實驗室 江蘇 揚州 225002）

利福平（RFP)是從利福霉素B得到的一種半合成抗生素，能抑制細菌DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA，達到殺菌作用。絕大多數(shù)的RFP耐藥相關基因是rpoB（RNA聚合酶 β亞基），rpoB基因的突變會引起RFP與細菌RNA聚合酶的親和力降低，導致細菌對RFP耐藥[1]。rpoB基因的突變主要是密碼子507到533（RNA聚合酶（rpoB)β-亞單位的81-by）熱點區(qū)域。514位和533位密碼子突變是引起低水平耐藥的常見突變位點。D516V，H526Y， H526D，S531L，這4個位點的突變是引起高水平耐藥的常見突變[2]。某些密碼子突變引起的rpoB基因突變并不會導致細菌對RFP耐藥。本研究利用基因芯片技術對揚州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌RFP耐藥基因突變位點特征進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2017年經(jīng)傳統(tǒng)固體培養(yǎng)，并經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株共346例。

1.2 儀器與試劑

儀器：基因芯片儀器、試劑由北京博奧生物有限公司提供；固體培養(yǎng)和藥敏試劑由珠海貝索生物有限公司提供?；蛐酒瑱z測RFP rpoB基因6個位點，共13種突變型：511位CTG→CCG，513位CAA→CCA、CAA→AAA，516位GAC→GTC、GAC→TAC、GAC→GGC，526位CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CTC、CAC→CGC，531位TCG→TTG、TCG→TGG，533位CTG→CCG。

1.3 方法

1.3.1 痰液化處理 將痰標本用4%的氫氧化鈉（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接種固體培養(yǎng)基和核酸提取。

1.3.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)嚴格按《結(jié)核病實驗室檢測操作規(guī)程》的要求進行，采用PNB和TCH進行鑒定，并定期用H37RV進行質(zhì)控。

1.3.3 核酸提取 煮沸法提取核酸。

1.3.4 基因芯片 核酸進行PCR擴增，產(chǎn)物用雜交緩沖液處理后進行雜交，再用芯片洗干儀進行洗滌和甩干，最后用芯片判別系統(tǒng)進行掃描和結(jié)果判讀，并詳細記錄芯片信息判讀結(jié)果。

2.結(jié)果

346 例結(jié)核分枝桿菌中耐利福平例數(shù)為58例（16.7%）。 58例利福平耐藥標本中，RFP耐藥相關基因rpoB基因的531（TCG→TTG）突變位點為34例（58.6%），526（CAC→TAC）突變位點為12例（20.7%），526（CAC→CGC）突變位點為5例（8.6%），526（CAC→GAC）突變位點為1例（1.7%），516（GAC→GTC）突變位點為1例（1.7%），516（GAC→TAC）突變位點為1例（1.7%），511（CTG→CCG）突變位點為4例（7.0%）。

3.討論

MTB耐藥性的增加，導致耐藥結(jié)核病感染率逐年上升，加大了結(jié)核病防治的難度。許多研究表明，耐藥基因突變導致是導致MTB耐藥的主要原因，通過檢測相關耐藥基因是否發(fā)生突變，從而可推斷該MTB是否發(fā)生耐藥?；蛐酒夹g是近些年比較流行的一種基因檢測的分子技術，其通過PCR技術對待測菌的基因片段進行擴增，將擴增片段與芯片雜交，即可得到基因突變位點和突變類型。該法具有快速、高通量、靈敏等特點[3]，近來在MTB耐藥檢測中應用廣泛，我們前期的研究[4]也驗證了基因芯片在MTB異煙肼耐藥檢測中具有較好的應用效能。

RFP主要作用于結(jié)核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位，干擾轉(zhuǎn)錄的開始及RNA延伸，發(fā)揮抑菌和殺菌作用。絕大多數(shù)MTB對RFP產(chǎn)生耐藥是由于rpoB基因507-533位發(fā)生了突變。rpoB基因507-533位區(qū)域稱為利福平耐藥決定區(qū)（RRDR），約85%的耐藥菌株出現(xiàn)531位Ser位點、526位His和516位Asp的變異。本次實驗采用博奧公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥試劑盒檢測rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533位密碼子，結(jié)果顯示揚州地區(qū)531、526突變位點為優(yōu)勢突變位點，其中531位占58.6%，526位占31.0%，最常見突變位點為531（TCG→TTG）突變位點（58.6%）和526（CAC→TAC）突變位點（20.7%），與相關文獻結(jié)果相似[5，6]。

另外據(jù)相關報道最近在RFP 耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)了兩個新的rpo B突變（Ser531Gly和 Asp516Thr），以及一個不屬于rpo B基因的突變位點（Ile572Phe）[7]。然而博奧結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑無法包含上述所有突變基因和突變形式，在檢測的結(jié)果中，有可能出RFP實際上耐藥而結(jié)果敏感的情況，因此該方法檢測的RFP敏感只能作為參考，并不能明確診斷，是該方法的缺點。