枸杞果實中蘆丁 及其酸水解產(chǎn)物槲皮素的研究

曹虎靈 薛朝金

枸杞子作為藥食兩用的原料，是茄科植物寧夏枸杞的干燥、成熟果實，其性平、味甘，具有滋補肝腎、益精明目的作用，可用于虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等癥狀，具有很高的食用價值。枸杞子中還含有黃酮類化合物，其中的蘆丁具有抗自由基活性、降低毛細(xì)血管通透性、抗炎等多方面的藥理活性。枸杞子作為藥食兩用品種，民間常將其加工成各種食品、飲料、保健酒、保健品等，而人們平常多用普通白酒進(jìn)行浸泡后飲用。

本文以從市場購買的枸杞果實為實驗材料，考察提取蘆丁時不同濃度乙醇和不同超聲時間對其含量的影響。同時以其水解產(chǎn)物槲皮素為指標(biāo)，考察蘆丁在不同酸濃度下的水解程度。

一、相關(guān)材料和儀器

1.實驗材料。實驗原料：枸杞子，采購于市場（生產(chǎn)企業(yè)：某藥業(yè)有限公司）。

實驗試劑：蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，HPLC含測：91.9%）;槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，HPLC含測：97.4%）;無水乙醇（分析純）;鹽酸;硫酸;甲醇（色譜純）;超純水。

2.實驗儀器。AgiLent1260高效液相色譜儀;電子分析天平（德國賽多利斯股份公司）;恒溫水浴鍋（上海榮豐科學(xué)儀器有限公司）;超聲波清洗機（潔康PS-G60A）。

二、實驗方法

1.色譜條件。色譜柱：DiamonsiL C18（5μm，200mm×4.6mm，8025364）;流動相：甲醇∶0.2%磷酸（45∶55）;流速：1.0mL/min;檢測波長：360nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量均為10μL。

2.對照品溶液制備。取蘆丁對照品和槲皮素對照適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1mL含蘆丁40μg、槲皮素40μg。

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密量取1μg/mL的蘆丁對照品貯備液1、2、4、8mL置于10mL容量瓶中，50%乙醇定容，制成4、8、16、32、40μg/mL的蘆丁對照品溶液和槲皮素對照品溶液。色譜分析時，對照品溶液過0.45μm有機系微孔濾膜。各吸取10μL進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算，得蘆丁回歸方程Y=536.5X-357.8，R=0.9994，表明蘆丁在4-40μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

4.樣品溶液制備。（1）蘆丁在不同乙醇濃度的制備方法。枸杞子60g烘干，粉碎，過3號篩，取約5g，精密稱定，置三角燒瓶中，分別精密加40%、50%、55%、60%乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，再分別用相應(yīng)濃度乙醇補足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，作為供試品溶液B。

（2）蘆丁在不同的超聲時間的制備方法。取上述粉末，分別精密加入55%乙醇50mL，密塞，稱定重量，分別超聲30min、40min、50min、60min，放冷，再稱定重量，再分別用相應(yīng)濃度乙醇補足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，作為供試品溶液A。

（3）槲皮素的制備方法。精密稱取上述粉末約5g，置三角燒瓶中，蘆丁提取條件根據(jù)最優(yōu)條件（55%乙醇、超聲30min）進(jìn)行制備。精密量取25mL，蒸至近干，分別加入1%硫酸、3%硫酸、5%硫酸、7%硫酸25mL，密塞，稱定重量，加熱回流2h，放冷，用相應(yīng)濃度硫酸補足減失的重量。用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯提取液蒸干，殘渣加50%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加55%乙醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液C。

5.精密度試驗。取對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蘆丁峰面積的RSD為0.8%，表明精密度良好。

6.重復(fù)性試驗。取枸杞子細(xì)粉，平行制備6份供試品溶液，分別測定，結(jié)果蘆丁含量的平均值（n=6）為1.81%，RSD為1.3%;槲皮素含量的平均值（n=6）為1.56%，RSD為0.9%，表明重復(fù)性良好。

7.穩(wěn)定性試驗。取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣10μL，結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為1.1%，槲皮素峰面積的RSD為1.0%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

8.回收率實驗。精密稱取已知含量的樣品，加蘆丁對照品適量，按供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，測定平均回收率為99.1%，RSD為1.32%。

三、結(jié)果與分析

1.色譜條件優(yōu)化。（1）檢測波長的選擇。取對照品溶液，比較在256、286、320、342、360nm的HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)360nm處色譜峰分離情況良好，各組分均有較大吸收，故選定360nm為色譜分析的檢測波長。

（2）流動相及洗脫方式的選擇。以甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸體系為流動相進(jìn)行等度洗脫試驗，結(jié)果表明以甲醇-0.2%磷酸（45∶55），分離效果較好。

2.蘆丁提取條件優(yōu)化。精密吸取供試品溶液A、B、C各10μL，注入液相色譜儀，測定不同乙醇濃度、超聲時間下蘆丁的提取結(jié)果，試驗結(jié)果見表1、表2。結(jié)果表明：隨乙醇濃度的增加，測得蘆丁含量呈上升趨勢，在乙醇濃度為60%時趨于平穩(wěn)，故選乙醇濃度55%為宜。而隨超聲時間不斷延長，測得蘆丁含量呈上升趨勢，超聲時間60min時趨于平穩(wěn)，故選擇超聲60min為宜。

3.槲皮素酸水解條件優(yōu)化。由表3可知，隨著硫酸濃度的增加，蘆丁水解效果明顯，在硫酸為5%時水解產(chǎn)物槲皮素達(dá)到最大值。硫酸濃度為7%時，蘆丁水解基本完成，槲皮素的含量急劇減少，說明在這個濃度下槲皮素也開始進(jìn)行水解。所以，蘆丁水解成槲皮素的最優(yōu)條件是硫酸濃度為5%。

四、討論

經(jīng)過試驗，枸杞子中蘆丁的最優(yōu)提取條件為乙醇濃度55%、超聲時間60min;蘆丁水解成槲皮素最優(yōu)條件為5%硫酸。試驗過程中同時使用鹽酸對蘆丁進(jìn)行水解，槲皮素未檢測出，試驗結(jié)果不顯著。本方法對枸杞子的提取條件進(jìn)行了一定的摸索，為后續(xù)評價和控制枸杞子的質(zhì)量提供了方法，并對其食用價值提供了依據(jù)。

作者簡介：曹虎靈（1986-），男，貴州龍里人，碩士研究生，工程師，研究方向為食品藥品檢驗。

薛朝金（1975-），貴州畢節(jié)人，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。