五糧液釀酒微生態(tài)與風(fēng)味化學(xué)研究進展

鄭 佳，趙 東，楊康卓，張建敏，劉 芳

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

五糧液，古稱“重碧春、姚子雪曲、雜糧酒”等，是我國傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒的典型代表[1]。獨具特色的“5種糧食配方、包包曲、跑窖循環(huán)、雙輪底發(fā)酵、分層起糟、分層蒸酒、量質(zhì)摘酒、沸點量水”等優(yōu)秀的傳統(tǒng)釀造技藝在全國釀酒行業(yè)全面推廣，極大程度上促進了我國白酒釀酒技術(shù)水平的發(fā)展。五糧液是我國多糧濃香型白酒的典型代表，老八大名酒之一，具有香氣悠久、味醇厚、入口甘綿、入喉凈爽、各味協(xié)調(diào)、恰至好處，尤以酒味全面而著稱的獨特酒體風(fēng)格[2]。五糧液的釀造過程從包包曲制曲到糟醅發(fā)酵等多環(huán)節(jié)都與微生物及其棲息的環(huán)境息息相關(guān)，而原產(chǎn)地環(huán)境中微生物的類型、5種糧食配伍、糟醅理化結(jié)構(gòu)、600年明初古窖池、窖池內(nèi)厭氧狀態(tài)下復(fù)雜菌群的共酵等多種因素決定了五糧液特殊的酒體風(fēng)格[3]。研究各環(huán)節(jié)微生物群落的組成與相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性是調(diào)控發(fā)酵過程的主要依據(jù)，因而，本文結(jié)合微生物學(xué)技術(shù)和風(fēng)味化學(xué)技術(shù)的發(fā)展歷程，回顧這些技術(shù)的不同發(fā)展時期在詮釋五糧液傳統(tǒng)工藝中取得的進展。

1 釀酒微生態(tài)研究進展

20世紀(jì)30年代初，我國老一輩微生物學(xué)家方心芳、陳騊聲等采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)研究大曲的霉菌、酵母的成果奠定了我國釀酒微生物發(fā)展的基礎(chǔ)，促進了工業(yè)微生物的發(fā)展。新中國成立初，“三大試點”這一系列重要歷史事件是對“濃、清、醬”三大白酒香型在工藝操作參數(shù)、風(fēng)味物質(zhì)分析以及特殊功能菌株的篩選等方面進行了系統(tǒng)的分析[4]。1980年至2000年，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法廣泛應(yīng)用于功能菌株的選育，2000年后分子生物學(xué)技術(shù)逐漸廣泛應(yīng)用于釀酒微生物群落的分析中。

目前，微生物群落的研究技術(shù)主要包括了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)、生物標(biāo)記法和現(xiàn)代分子生物學(xué)免培養(yǎng)技術(shù)。下面就五糧液釀造過程中各環(huán)節(jié)涉及的微生物研究進行詳細(xì)論述。

1.1 包包曲

俗語道“曲乃酒之骨”，大曲不僅作為白酒發(fā)酵的糖化劑和發(fā)酵劑，更是白酒糟醅發(fā)酵過程中微生物和粗酶制劑的主要來源之一。大曲的培養(yǎng)過程是原料表面附著的自然環(huán)境中微生物受曲塊自身理化變化及曲房溫濕度等因素影響而發(fā)生定向演替并形成特殊群落結(jié)構(gòu)的過程。五糧液釀造用大曲為包包曲，屬于中溫偏高溫曲，因“包包”部位較厚，在培菌過程中其品溫相對較高，可達(dá)63℃。不同地域的中高溫曲中微生物群落的研究結(jié)果[5-6]認(rèn)為，芽孢桿菌種類和數(shù)量較多，細(xì)菌中優(yōu)勢菌群是乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等；曲塊不同部位微生物的差異比較結(jié)果認(rèn)為霉菌尤其是根霉(Aspergillus)是曲塊側(cè)面和曲包表層的優(yōu)勢類群，曲心的優(yōu)勢菌群主要是芽孢桿菌，曲塊底面主要是青霉和犁頭霉，而黃曲霉、紅曲霉和酵母菌在曲塊各部位均有檢出。趙東等[7-8]分析了五糧液包包曲培曲過程中細(xì)菌、酵母和霉菌的變遷規(guī)律，認(rèn)為包包曲培養(yǎng)過程中枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌占絕對優(yōu)勢；同時，在曲坯發(fā)酵過程中，酵母菌、霉菌和細(xì)菌的數(shù)量在前期急劇增加，第5天后顯著減少，14～18 d期間細(xì)菌有較大幅度的生長，隨后又下降。

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，宏基因組測序是近年來快速發(fā)展并滲透至多學(xué)科的有效的基因測序手段，無需分離純培養(yǎng)單一菌株，提取體系基因組DNA后，直接在基因水平研究挖掘環(huán)境中微生物群落資源，同時，該方法體系具有成本低、通量高、覆蓋率高等優(yōu)點。施思等[9-10]利用MiSeq高通量測序平臺分析了包包曲在貯存過程中原核微生物和真核微生物菌群的變化規(guī)律，包包曲中主要的原核微生物包括 Bacillus、Lactococcus、Thermoactinomyces、Sebaldella、Weisilla等，真核微生物包括Pichia、Rhziopus、Lichtheilia、Saccharomycopis等。陳玲等[11]基于Illumina Miseq測序平臺分析了某濃香型大曲中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)組成，高通量測序發(fā)現(xiàn)了13個門，22個綱，33個目，61個科，133個屬，厚壁菌門（79.32%）、變形菌門（15.04%）和放線菌門（1.77%）是優(yōu)勢的細(xì)菌菌群，在屬的分類水平中Bacillus、Lactobacillus、Weissella、Pantoea、Lactococcus等是優(yōu)勢屬。

1.2 糟醅

高粱、玉米、小麥、糯米、大米5種糧食配方是五糧液區(qū)別于其他中國白酒的特色之一。趙東等[12-13]分析了五糧液糟醅發(fā)酵過程中細(xì)菌（好氧、兼性厭氧）、酵母和霉菌的變化趨勢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)好氧細(xì)菌、酵母菌和霉菌數(shù)量在發(fā)酵初期急劇增加，5 d后急劇減少；而兼性厭氧細(xì)菌數(shù)量在發(fā)酵前期急劇增加，而后急劇減少；發(fā)酵5～15 d酵母菌占優(yōu)勢，到15 d后，則是兼性厭氧細(xì)菌占優(yōu)勢。進一步分析不同空間糟醅發(fā)酵過程中[13]微生物分布狀況發(fā)現(xiàn)，中層糟醅的好氧細(xì)菌數(shù)量略大于上層和下層，下層糟醅中酵母菌和兼性厭氧菌數(shù)量最多。

1.3 窖泥

泥窖發(fā)酵是濃香型白酒顯著區(qū)別于其他類型白酒的典型特征。泥窖窖池，窖池四壁和底面均粘附有老窖泥，由于窖池內(nèi)窖泥與糟醅長期接觸，在糟醅的浸潤下，窖泥吸收了大量的酸、酯、醇和其他營養(yǎng)物質(zhì)，供給窖泥中棲息的微生物生長、繁殖，糟醅發(fā)酵時，窖泥中的微生物又進入糟醅中增殖代謝。糟醅中的特殊風(fēng)味成分在長期不間斷續(xù)糟發(fā)酵過程中不斷積累，糟醅與窖泥的長期互動形成了“以糟養(yǎng)窖，以窖促糟，糟窖互養(yǎng)”的良好生態(tài)環(huán)境。由于不同釀酒原料為窖泥微生物營造的理化環(huán)境截然不同。20世紀(jì)90年代初，吳衍庸等[14]基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)剖析了五糧液老窖泥中厭氧微生物的群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，己酸菌和厭氧異養(yǎng)菌等隨窖齡延長而增加，己酸菌、甲烷菌等隨窖池上、中、下位置順序遞增。最近，趙東等[1]利用高通量基因測序方法深入研究了五糧液窖泥中原核微生物群落的組成，共檢出22個門，52個綱，89個目，168個科，330個屬，細(xì)菌是原核微生物群落的優(yōu)勢菌群細(xì)菌，占總菌數(shù)的92.3%。厚壁菌門（Fimicutes）是所有樣品的絕對優(yōu)勢菌群（85.6%），共檢出74個屬，Clostridium、Lactobacillus、Coprococcus、Caldicoprobacter、Soehngenia 是豐度最高的細(xì)菌屬；五糧液窖泥中蘊藏了顯著區(qū)別于其他濃香型白酒窖泥的原核微生物群落，尤其是群系復(fù)雜的厚壁菌門細(xì)菌、較高豐度的產(chǎn)己酸菌群和促進己酸生成的甲烷菌群?？梢?，以五糧液為典型代表的濃香型白酒與醬香型、清香型等其他香型白酒在發(fā)酵設(shè)備及機理方面存在巨大差異，復(fù)雜的窖池微生態(tài)菌群是造就五糧液特殊酒體風(fēng)格的根本原因之一。

2 風(fēng)味化學(xué)研究進展

白酒風(fēng)味物質(zhì)中，除了極少量的無機化合物（固形物）之外，絕大部分是有機化合物，均具有揮發(fā)性，起到呈香呈味的特定作用。這些風(fēng)味物質(zhì)是構(gòu)成白酒典型特征的物質(zhì)基礎(chǔ)。它們以一定的比例共存于酒體中，互相配合、補充、襯托和制約，發(fā)揮各自的特點，形成不同香型和不同風(fēng)格的白酒。白酒香味物質(zhì)十分復(fù)雜，種類繁多，含量微少，能夠完全說清楚其來源實非易事。結(jié)合白酒的生產(chǎn)工藝及各類物質(zhì)的生成機理，白酒的風(fēng)味物質(zhì)來自于原料、制曲產(chǎn)生的前體物質(zhì)、窖泥中香氣的轉(zhuǎn)移和陶壇陳釀等，形成了白酒獨特的酒體風(fēng)格。

2.1 釀酒原（輔）料中的風(fēng)味物質(zhì)

原料是酒類釀造的基礎(chǔ)，經(jīng)處理后的原料不僅為發(fā)酵過程中微生物的新陳代謝提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時其中含有的大量香氣前體物質(zhì)和功能成分等顯著影響產(chǎn)品的風(fēng)味。對5種糧食香氣前體物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，有35種結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)，包括酯、酸、醇、醛酮、萜烯、芳香族等，如苯乙醛、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、β-大馬酮、α-柏木烯、α-萜品烯、香葉基丙酮、脫氫-β-紫羅酮等[15]，這些結(jié)合態(tài)香味前體物質(zhì)在發(fā)酵過程中，受酶類、有機酸等因素的作用直接或間接形成游離態(tài)的呈香呈味成分。謝正敏[16]、練順才[17]、彭智輔[18]、葉華夏[19]等采用同時蒸餾萃取和頂空固相微萃?。℉S-SPME）法定性分析了玉米、高粱、大米、糯米和小麥中的香氣成分，發(fā)現(xiàn)了不同原料中大量的香氣物質(zhì)。我們的最新研究結(jié)果表明[20]，生產(chǎn)用五糧粉中含有獨特的風(fēng)味物質(zhì)，一次蒸煮餾出液中最重要的香氣活性成分包括2-甲基丁醛、己醛、(E)-2-庚烯醛、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚、鄰甲酚、對甲酚、己酸乙酯、二甲基三硫醚和β-大馬酮（香氣稀釋因子（FD）≥81）。

2.2 包包曲中的風(fēng)味物質(zhì)

大量研究證實中國白酒釀造大曲不僅為釀酒過程提供了酶類、微生物菌種，而且大曲在制曲過程中產(chǎn)生的香氣成分或香氣前體物質(zhì)對白酒釀造產(chǎn)生著重要的影響。五糧液包包曲采用純小麥制曲，屬偏高溫大曲。趙東等[21]首次將HS-SPME應(yīng)用于研究包包曲粉中的香氣成分，共檢出揮發(fā)性成分68種，其中近30種吡嗪物質(zhì)以及與成品酒香氣成分相似的化合物，如乙酸、己酸、己酸乙酯等。Zheng等[29]首次集成現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)主流研究手段包括感官分析、色譜-感官嗅辯分析、色譜定量分析、香氣貢獻度評價以及多元統(tǒng)計學(xué)分析等，系統(tǒng)研究了包包曲制曲過程中香氣成分的變化規(guī)律，包包曲的感官特征從升溫階段的酸澀味、果香味和面包味（3 d和7 d）演變?yōu)榻禍仉A段的堅果味和稍許霉味（18 d、21 d和27 d）；根據(jù)香氣時間強度值（Osme），表明乙酸、甲硫醇、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是香氣活性成分。

2.3 窖泥的風(fēng)味物質(zhì)

五糧液不同空間窖泥與糟醅的互動關(guān)系研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，窖邊糟與窖泥的揮發(fā)性香氣成分的組成類似，含量差異大，窖泥中檢出的酯類數(shù)量較多，而這些酯類成分不僅僅局限于乙酯類化合物，優(yōu)勢酯類成分包括乙酸乙酯、戊酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、己酸己酯、己酸丁酯、癸酸乙酯、辛酸丁酯等[22]。而單糧濃香型白酒窖泥揮發(fā)性香氣成分的研究結(jié)果表明，己酸、己酸丁酯、己酸己酯是窖壁泥的主要成分，而窖底泥中亦含有豐富的己酸甲酯[23]。

2.4 獨特的發(fā)酵工藝形成的風(fēng)味物質(zhì)

白酒采用固態(tài)發(fā)酵、混蒸混燒工藝，蒸餾后的糟醅拌合曲粉進行邊糖化邊發(fā)酵的多邊發(fā)酵機制，且發(fā)酵時間較長，發(fā)酵期60～90 d，尤其是五糧液雙輪底工藝的發(fā)酵期超過了100 d，極大程度地增加了底窖中糟醅香味成分的積累程度。五糧液是固態(tài)續(xù)糟發(fā)酵的典型代表，其獨特的“跑窖循環(huán)、雙輪底發(fā)酵、分層起糟、分層蒸餾、量質(zhì)摘酒、沸點量水”等突出傳統(tǒng)工藝是保證五糧液獨特酒體風(fēng)格穩(wěn)定的根本。趙東等[24]利用HS-SPME法定性分析了糟醅中的芳香族成分，檢出了4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、乙縮苯乙醛、香草醛等。由于白酒糟醅蒸餾操作并不能完全將糟醅中的香味成分完全蒸出，蒸餾后的糟醅中還殘留了大量的香味成分，總提取效率底窖糟和面糟分別為8%和11%，乙酸乙酯提取6.62%～9.62%，己酸乙酯提取32.54%～29.39%、乳酸乙酯提取8.24%～10.41%、己酸-乙酸-乳酸殘留90%以上[25]。因此“萬年糟”中富含的呈香呈味物質(zhì)是保證五糧液酒質(zhì)風(fēng)格穩(wěn)定的根本因素之一。

2.5 蒸餾及陳釀對白酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

白酒蒸餾器是一個結(jié)構(gòu)特殊的桶狀蒸餾器，現(xiàn)代化生產(chǎn)中已廣泛使用耐酸堿腐蝕的不銹鋼甑桶。糟醅屬固體基質(zhì)，其在甑桶中的疏松程度極大影響了白酒蒸餾效率，故糟醅裝甑均采用人工裝甑的方式。糟醅通過人工方式層層裝填到甑桶中，形成了一個特殊的填料塔，水蒸氣從甑桶底部逐漸穿透至糟醅頂層，糟醅層與層之間溫度差造成了下層香味組分濃度在上層糟面冷凝，如此方式，甑桶內(nèi)糟醅中酒精和香味成分經(jīng)過復(fù)雜的濃縮過程。原酒的陳釀則用陶壇，陳釀周期為1～3年。研究結(jié)果表明，五糧液白酒中優(yōu)勢香味成分主要以酯類物質(zhì)為主，其次為有機酸類，如己酸乙酯（1984 mg/L）、乳酸乙酯（1354 mg/L）、乙酸乙酯（1264 mg/L）、乙酸（465 mg/L）、己酸（296 mg/L）、乳酸（257 mg/L）、丁酸（104 mg/L）、乙縮醛（468 mg/L）、乙醛（355 mg/L）、雙乙酰（118 mg/L）等[26]。

現(xiàn)代風(fēng)味化學(xué)香氣貢獻度評價結(jié)果指出，對五糧液香氣的貢獻作用較大的揮發(fā)性成分包括丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯、己酸、1，1-二乙氧基-3-甲基丁烷、2，5-二甲基-3-乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪，3，5-二甲基-2-戊基吡嗪等[27]。低度五糧液與高度五糧液的比較結(jié)果認(rèn)為[2]，低度與高度五糧液中骨架香味成分的相對比例較一致，低度白酒在己酸乙酯等骨架成分上含量低于高度五糧液；同時，果香類骨架物質(zhì)（己酸乙酯、丁酸乙酯等）的香氣強度順序基本一致，能使低度與高度五糧液在氣味風(fēng)格保持一致，而酸類物質(zhì)和芳香族類物質(zhì)在低度與高度五糧液中優(yōu)勢物質(zhì)的排列順序不同，尤其是部分呈顯著藥材香和甜香味物質(zhì)（苯乙酸乙酯、4-甲基愈創(chuàng)木酚等）。

3 展望

目前為止，采用高通量測序法分析得到了與釀酒相關(guān)的微生物菌群大于300個屬，采用現(xiàn)代色譜分析儀器從白酒中定性分析到的風(fēng)味物質(zhì)達(dá)1000種以上，這些手段極大程度上擴展了我們認(rèn)識白酒釀造過程涉及的微生物及與之相關(guān)的風(fēng)味物質(zhì)。然而我們對混菌發(fā)酵體系中微生物代謝的本質(zhì)規(guī)律仍然不夠深入，復(fù)雜體系中代謝網(wǎng)羅的相互交錯使得我們認(rèn)識白酒發(fā)酵機理困難重重。最近，一種直接研究微生物群體和他們棲息的環(huán)境或者宿主相互關(guān)系、作用機制的研究依然興起，這便是微生物組[28]?；谖⑸锝M中多種現(xiàn)代分析手段（高通量測序、高通量菌株篩選等）將對白酒釀造全過程的認(rèn)識與改造產(chǎn)生重要影響，同時，對特定微生物群體代謝的調(diào)控手段將為白酒發(fā)酵代謝調(diào)控提供重要思路。