當歸DNA提取及其分子鑒定研究

摘要：本文通過綜述當歸分子的基因組DNA提取方法及其檢測方法以及其分子鑒定的方法，提供給大家有效提取當歸基因組DNA分子的一些改進思路，有望為當歸分子基因組DNA提取的方法及其分子鑒定方法的完善提供一些理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：當歸;DNA分子;分子鑒定

1.取樣

當歸作為重要的中草藥成分，經(jīng)過加工，加入到藥品中，不同相態(tài)的藥品中的當歸成分取樣方法各不相同，基因組DNA不同的提取方法也不同。傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法現(xiàn)在多以這些方式對不同相態(tài)中的藥品進行取樣：藥片、散劑和藥丸，稱量后用研磨法取樣;膠囊類藥品脫去外殼后，直接稱量即可;液體藥劑直接用移液槍抽取合適的量即可。

2.DNA分子提取

DNA分子的提取方法較多：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法，十二烷基磺酸鈉（SDS）法以及磁珠法等，這三種提取方法在中草藥成分的基因組DNA提取中都比較常用。其中CTAB法為經(jīng)典的DNA提取方法，許多物種的DNA都可以用它來提取，且經(jīng)濟易得，但其在當歸DNA分子提取中一直難以應(yīng)用。

最近幾年，當歸基因組DNA分子的提取一直是一個研究熱點，有研究者將中草藥中提取DNA的方法在當歸基因組DNA分子提取中都做了實驗，尤其是對傳統(tǒng)CTAB法進行了深入的研究，研究結(jié)果顯示：單一的使用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取藥品中當歸基因組DNA分子的方法不可取，提取雜質(zhì)多甚至于難以提出，但先用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取藥品中當歸基因組DNA分子，然后再用試劑盒進行后續(xù)提純處理，會大大提高實驗的完成度和準確性，遠勝于其他一些提取藥物中當歸基因組DNA分子的提取方法。

3.DNA分子檢測

3.1設(shè)計引物

根據(jù)目標基因片段的堿基序列按引物設(shè)計的一般原則設(shè)計引物，引物設(shè)計的好壞直接關(guān)系到PCR擴增的結(jié)果。

3.2PCR擴增

PCR技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)的常用的技術(shù)，是在體外模擬基因序列擴增的技術(shù)，可實現(xiàn)基因組序列短期內(nèi)的快速擴增，放大特定的基因序列，便于檢測。這項技術(shù)大致可分為三個部分：高溫變性，使目的基因的雙鏈在95°C高溫下被打開;低溫退火，使引物與單鏈按照堿基互補配對選擇進行結(jié)合，一般需要自己進行溫度梯度，尋找合適的退火溫度，通常退火溫度在60°C左右;適溫延伸，在DNA聚合酶的最適溫度72°C下，DNA聚合酶可以沿著磷酸到五碳糖（5-3）的方向合成互補鏈，最終完成目的基因序列的擴增。

3.3瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計測量法

瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)是檢測DNA完整性和濃度比較好的一項技術(shù)，可以通過與PCR技術(shù)的結(jié)合，完成多種檢測任務(wù)，比如：目的基因的鑒定。該方法采用瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)，提供以堿性緩沖液環(huán)境來檢測大分子量的核酸，可以用大一點的點樣孔進行電泳檢測。電泳完成后有后續(xù)實驗需要可進行目的條帶的切膠回收。同樣，紫外分光光度計也可以檢測微量基因組DNA的濃度，但對特異性DNA的檢測沒有瓊脂糖凝膠電泳效果好，兩者可以結(jié)合用于當歸基因組DNA的檢測。

4.當歸分子的鑒定研究

DNA條碼技術(shù)是中草藥成分鑒定最為普遍的一項技術(shù)，通過對提取的樣本基因組DNA中的線粒體細胞色素C氧化酶亞基1（CO1）基因序列進行PCR擴增，并與其數(shù)據(jù)庫進行對比分析，從而實現(xiàn)物種的快速、準確的鑒定與分離。這項技術(shù)同時涉及到了當歸基因組DNA的提取和其CO1基因序列的擴增，所以能很好的從藥物中提出當歸分子的基因組DNA和進行目的基因的擴增仍是基礎(chǔ)，包括檢測特異性條帶的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。

除了可以快速鑒別與分離出物種的DNA條碼技術(shù)之外，有研究者提出，用葉綠體中的trnL-F序列也可以實現(xiàn)當歸的分子鑒定。當歸分子制成藥品的加工過程中，基因組DNA偶有損傷，而葉綠體基因組相對于核基因組來說容易保留，不易被破壞，其基因序列更易得到擴增，從而完成對當歸分子的鑒定。因此，我們可以鑒此思路，從線粒體和葉綠體的基因組中，尋找適合做當歸分子鑒定的基因序列，也就是在藥品加工過程中最不易被破壞的那部分基因序列，提高鑒定效率。

展望

當歸是重要的中草藥成分，在治療方面發(fā)揮著重要的作用。因此，從含有當歸成分的藥中成功檢測出當歸DNA分子顯得尤為重要。一方面要綜合現(xiàn)在分子生物學(xué)技術(shù)：PCR技術(shù)，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)等，保證DNA分子的完整性和成功鑒定;另一方面利用DNA條碼技術(shù)，實現(xiàn)當歸分子的特異性鑒定。本文綜述了當歸DNA分子提取及其分子鑒定中用到的一些技術(shù)，希望為藥物中當歸成分的有效鑒定提供一些理論依據(jù)。

基金項目：貴州省2017年度黔南州社會發(fā)展科技計劃項目“黔南地區(qū)當歸道地性相關(guān)的遺傳信息研究”（編號：黔南科合社字（2017）1號）

作者簡介：任永超（1989-），男，貴州都勻人，漢族，研究生，工程師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。