禽法氏囊、腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制備與檢驗(yàn)

吳衛(wèi)東 魏中鋒 徐梅 岳立

（1，山東省菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 274000；2，山東省菏澤市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 274000）

雞傳染性法氏囊病是一種重要的雞免疫抑制?。?］，目前國(guó)內(nèi)同時(shí)存在經(jīng)典毒株、變異毒株和超強(qiáng)毒株，經(jīng)常導(dǎo)致雞群的免疫失敗，給禽業(yè)養(yǎng)殖造成重大的損失［2］。為了有效防治雞傳染性法氏囊病制備了法氏囊、腺病毒二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)檢驗(yàn)有效性良好。

1 材料

1.1 毒株

禽法氏囊、腺病毒疫苗毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的當(dāng)?shù)亓餍卸局辍?/p>

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF 雞胚、SPF 雞購(gòu)自山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院SPF 雞場(chǎng)。

1.3 主要試劑

注射用白油購(gòu)吉化江城油脂化工有限責(zé)任公司；硬脂酸鋁、司本-80、吐溫-80 均購(gòu)自湖北江民泰華化工有限公司湖北江民泰華化工有限公司。

1.4 主要儀器

型號(hào)為FSH-2 可調(diào)高速電動(dòng)勻漿器購(gòu)自金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠。

2 制備方法

2.1 病毒抗原的制備與檢驗(yàn)

2.1.1 種毒增殖

將禽法氏囊、腺病毒疫苗毒株分別用滅菌0.9%生理鹽水1000 倍稀釋后，通過(guò)卵黃囊接種 7～9日齡 SPF 雞胚 200 枚，0.2ml/胚，SPF 雞胚必須是經(jīng)檢測(cè)無(wú)禽法氏囊、腺病毒感染史和免疫史，37℃孵育48～120h，在此過(guò)程中無(wú)菌收集死亡雞胚的尿囊液，存放于-20℃保存。

2.1.2 種毒含量的測(cè)定

將種毒增值后的尿囊液用滅菌生理鹽水依次進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 倍稀釋，取每個(gè)稀釋度的病毒液經(jīng)卵黃囊途徑分別接種7～9日齡SPF 雞胚16枚，接種量為0.1ml/胚，將接種的雞胚置于37℃按照孵化技術(shù)孵育168h，進(jìn)行每天記錄死亡雞胚數(shù)量，按照Reed-Muench法計(jì)算增值種毒液對(duì)SPF 雞胚的半數(shù)致死量（ELD50）。

2.1.3 種毒液滅活

將增殖后的種毒液加入最終含量為0.1%甲醛攪拌均勻后，放置于60℃水浴鍋中滅活3h，種毒液經(jīng)甲醛滅活后置2～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 滅活疫苗的制備

2.2.1 油相制備

取注射用白油94 份，硬脂酸鋁1 份，加熱緩慢攪拌至完全融化，再加入司本-80 6 份，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笤?16℃高壓滅菌 30min，放置于 2～8℃保存。

2.2.2 水相制備

取高壓滅菌好的吐溫-80 4 份，法氏囊、腺病毒滅活抗原各48 份，混合加入，低速攪拌至兩者完全溶解，置于2～8℃保存。

2.3 滅活疫苗的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量檢驗(yàn)

2.3.1 物理性狀檢驗(yàn)

（1）肉眼仔細(xì)觀察滅活疫苗的顏色和性狀。

（2）黏度檢驗(yàn)，將 2～8℃保存的疫苗取出逐漸恢復(fù)至室溫25℃左右，用1ml 吸管吸取制備的疫苗1.0ml，使其從吸管中垂直流出，記錄流出0.4ml 所用時(shí)間是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 制備疫苗的效力試驗(yàn)

（1）疫苗抗體效價(jià)的測(cè)定將30 只21日齡SPF 雞隨機(jī)分成3 組（對(duì)照組、低免疫組、高免疫組），每組 10 只，低免疫組、高免疫組分別在頸部皮下注射滅活疫苗0.2ml 和0.5ml，對(duì)照組注射滅菌生理鹽水 0.5ml，在注射疫苗 1 周、2 周、3 周、4 周、2月、4月、6月后對(duì)各組的雞于進(jìn)行翅靜脈處采血，每只雞采血0.5ml，用離心機(jī)分離血清。將分離的血清做2 倍的梯度倍比稀釋，用10 倍濃縮的法氏囊、腺病毒滅活種毒作為檢測(cè)抗原，用瓊脂擴(kuò)散的免疫學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定每組雞的抗體效價(jià)，用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行各組試驗(yàn)雞數(shù)據(jù)方差分析和多重比較。

（2）攻毒保護(hù)試驗(yàn)。將購(gòu)買的 21日齡 SPF 雞 20 只隨機(jī)分成 2 組（對(duì)照組、試驗(yàn)組），每組 10 只，試驗(yàn)組每只雞在頸部皮下注射制備好的滅活疫苗0.5ml，對(duì)照組每只雞注射滅菌生理鹽水0.5ml。在注射21d 后采集對(duì)照組、試驗(yàn)組每只雞翅靜脈血0.5ml，離心分離血清，采用瓊脂擴(kuò)散方法測(cè)定每只雞的血清抗體效價(jià)，然后對(duì)所有雞點(diǎn)眼接種未滅活的法氏囊病毒液和肌肉注射未滅活的腺病毒液，接種量為0.1ml/只，在攻毒后每日記錄每只雞的臨床癥表現(xiàn)和發(fā)病死亡情況，對(duì)死亡的雞解剖檢驗(yàn)，記錄病理變化，在攻毒14d 后將所有活雞進(jìn)行解剖檢驗(yàn)，記錄病理變化。

3 結(jié)果

3.1 疫苗種毒病毒含量測(cè)定結(jié)果

按Reed-Muench 法計(jì)算法氏囊、腺病毒液的病毒含量ELD50 分別為 10-5.53/0.1ml 和 10-6.17/0.1ml，表明疫苗種毒病毒液中的病毒含量較高。

3.2 種毒抗原滅活檢驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)甲醛滅活后的法氏囊、腺病毒抗原接種7日齡SPF 雞胚0.1ml/胚，37℃孵育 168h 后，檢查雞胚無(wú)死亡，剖檢雞胚未出現(xiàn)任何病變，將孵育168h 雞胚的尿囊液盲傳3 代后也未發(fā)現(xiàn)雞胚死亡和剖檢病變，表明種毒抗原病毒液滅活徹底安全。

3.3 疫苗臨床安全性檢驗(yàn)結(jié)果

14日齡20 只SPF 雞在注射疫苗后，臨床觀察未出現(xiàn)任何異常情況，如減食、腹瀉、呼吸道炎癥等。在 14d 后，所有存活雞解剖后，觀察注射部位，注射疫苗已全部吸收，未產(chǎn)生疫苗吸收不良或炎癥情況。

3.4 疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)結(jié)果

在疫苗免疫后每周進(jìn)行采血檢測(cè)，試驗(yàn)組的抗體效價(jià)（log2）與對(duì)照組相比均顯著提高（P＜0.05）。在疫苗免疫后第一周和第二周的抗體效價(jià)（log2）差異均顯著（P＜0.05），在第四周后疫苗免疫每周采血檢測(cè)抗體結(jié)果差異均不顯著（P＞0.05）。低免疫組、高免疫組抗體效價(jià)均能在免疫28d 后的達(dá)到最高值，在維持2個(gè)月后才會(huì)出現(xiàn)緩慢下降情況，在注射疫苗4個(gè)月后，疫苗注射組的抗體效價(jià)仍能保持在4log2 以上。在注射疫苗6個(gè)月后，疫苗注射組的抗體效價(jià)仍處在3log2 以上。

3.4.2 SPF 雞攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

在攻毒3d 后，對(duì)照雞先后出現(xiàn)發(fā)熱、精神萎靡、拉黃綠糞便等臨床癥狀，7d 后所有對(duì)照組雞全部死亡，解剖可見(jiàn)心包積液、肝臟腫大、腺胃乳頭出血、法氏囊腫大出血、腿肌胸肌出血等法氏囊和腺病毒感染的典型病理變化。疫苗免疫組雞免疫后3 周后采血檢測(cè)法氏囊和腺病毒抗體效價(jià)平均值為4.40log2 和 4.52 log2，對(duì)照組為 0log2，在攻毒后 3 周內(nèi)未出現(xiàn)死亡，結(jié)果表明，制備的滅活疫苗能完全保護(hù)法氏囊和腺病毒強(qiáng)毒株的攻擊，滅活疫苗的免疫效果較好。

4 小結(jié)

禽法氏囊和腺病毒對(duì)目前雞養(yǎng)殖業(yè)已造成重大危害，尤其在有些地區(qū)還存在禽法氏囊和腺病毒混合感染的情況，本試驗(yàn)以本地分離流行毒株為疫苗種毒，成功制備出了法氏囊、腺病毒二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，并經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量檢驗(yàn)符合國(guó)家獸藥典標(biāo)準(zhǔn)。