淺談提高獸醫(yī)比對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的方法

屈生躍 張書光

(1，云南省盈江縣芒章畜牧獸醫(yī)站 678300；2，云南省德宏州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 678400)

為了加強(qiáng)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部每年都組織省級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)能力比對(duì)工作。省級(jí)比對(duì)完成后由各省組織各地州（市）級(jí)實(shí)驗(yàn)室參加比對(duì)。通過(guò)比對(duì)，可直觀的衡量出各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室管理中存在的不足，對(duì)獸醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室整體工作水平的提高起到積極推動(dòng)作用。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)具有可比較性和可重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易觀察和辨認(rèn)，能客觀反映出實(shí)驗(yàn)人員的水平和能力的優(yōu)點(diǎn)[1]。另外，由于近年來(lái)動(dòng)物防疫工作的需要，有的把實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接與目標(biāo)管理考核和績(jī)效考評(píng)掛鉤，有時(shí)一個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的好壞決定排名先后，甚至是年度工作績(jī)效和收入。因此，各地獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室非常重視這一實(shí)驗(yàn)。

1 ELISA

ELISA 實(shí)驗(yàn)最難以理解和最重要的就是公式的設(shè)定，以小反芻獸疫抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書為例。（1）計(jì)算公式：PI（抑制百分率）=100-（血清樣品 OD 值/M 孔平均 OD 值）×100；（2）結(jié)果判定成立條件：結(jié)果 PI≥50 為陽(yáng)性，PI＜50 為陰性。

由于酶標(biāo)儀只能設(shè)定臨界OD 值，所以要根據(jù)試劑盒說(shuō)明書計(jì)算出樣品OD 值＜多少為陽(yáng)性或陰性，很多實(shí)驗(yàn)室人員不會(huì)計(jì)算。詳細(xì)計(jì)算方法如下：將樣品OD 值設(shè)為X，M 孔平均OD值我們?cè)O(shè)為機(jī)器可以判定的PC1，帶入計(jì)算公式可以得出PI=100-（X/PC1）×100，根據(jù) PI≥50 為陽(yáng)性得出：100-（X/PC1）×100≥50 為陽(yáng)性，解不等式解出 X≦0.5×PC1 為陽(yáng)性，反之為陰性。因此樣品 OD 值的臨界值為 0.5×PC1，將 0.5×PC1 輸入機(jī)器即可完成機(jī)器公式的設(shè)定，陰陽(yáng)性對(duì)照成立條件計(jì)算方法是將陰陽(yáng)性對(duì)照作為血清樣品，同上計(jì)算出臨界值即可。

2 血凝與血凝抑制實(shí)驗(yàn)

2.1 1%紅細(xì)胞懸液的配制

洗紅細(xì)胞要保證紅細(xì)胞不能破裂，洗紅細(xì)胞要洗3～5 次，直上清清亮為止，移取時(shí)盡量輕取輕放；當(dāng)紅細(xì)胞配制濃度偏低時(shí)，終點(diǎn)判定很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，這也多是找不到實(shí)驗(yàn)失敗原因的主要問(wèn)題。

2.2 血凝實(shí)驗(yàn)

為準(zhǔn)確測(cè)量出血凝結(jié)，一般要求做3 排相同的實(shí)驗(yàn)。加紅細(xì)胞要注意防止" 掛滴” 現(xiàn)象的發(fā)生 (紅細(xì)胞沒(méi)有全部加到孔中，而是有一部分掛在吸嘴尖上)。HA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷時(shí)要求將板傾斜45°，觀察沉積紅細(xì)胞流淌情況，凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%紅細(xì)胞凝集作為血凝實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)很重要，如果終點(diǎn)孔中心有點(diǎn)狀沉積，都對(duì)以后的實(shí)驗(yàn)有較大的影響。紅細(xì)胞沒(méi)有充分打散或采血后血液與抗凝劑沒(méi)有充分混勻常出現(xiàn)這種情況。

2.3 抗原回測(cè)

抗原回測(cè)是適時(shí)檢測(cè)4 單位抗原配制是否準(zhǔn)確的重要方法[2]。從左至右第一列為4 單位抗原，第二列為2 單位抗原，第三列為一單位抗原，第四列為1/2 單位抗原。如果前三孔凝集，第四孔不凝集，則4 單位抗原準(zhǔn)確無(wú)誤；若4 孔都凝集，表示抗原濃度偏高；若前兩孔凝集，3、4 孔不凝集，則表示抗原濃度偏低。過(guò)高或者過(guò)低都建議重新配制，以免影響血凝抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

3 PCR

3.1 所有使用耗材的滅菌

參加比對(duì)實(shí)驗(yàn)前，一定要對(duì)所有用到的實(shí)驗(yàn)耗材進(jìn)行高壓滅菌和干燥，防止交叉污染。

3.2 提取核酸

建議使用全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行核酸提取，減少人為提取核酸造成的誤差；兩個(gè)人做平行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)提取。

3.3 PCR 和電泳

PCR 配體系、加樣和電泳都設(shè)置兩人平行操作，結(jié)果完全相同則直接提交結(jié)果，結(jié)果不一致的以業(yè)務(wù)水平較高的為準(zhǔn)。

4 討論

3 個(gè)實(shí)驗(yàn)最容易出錯(cuò)的是血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的失誤都會(huì)前功盡棄，因此，參加比對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)建議將血凝和血凝抑制實(shí)驗(yàn)分成兩步：第一步血凝實(shí)驗(yàn)、4 單位抗原配制和抗原回測(cè)，若抗原回測(cè)完全正確再開始第二步，如果抗原回測(cè)一直不正確或者血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常，一定要重新買雞從頭開始；第二步再加盲樣進(jìn)行血凝抑制實(shí)驗(yàn)。血凝抑制實(shí)驗(yàn)每一步也建議設(shè)置平行對(duì)照，兩人做出的結(jié)果分析評(píng)定后再行提交。