一例保育豬圓環(huán)病毒2 型與鏈球菌混染調(diào)查分析

莫添麟 韋成威 韋志文

(1，廣西河池市水產(chǎn)畜牧產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心 547000；2，廣西河池市金城江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 547000)

近10年來(lái)，廣西養(yǎng)豬業(yè)飛速發(fā)展，農(nóng)村散養(yǎng)逐漸減少，規(guī)?；B(yǎng)豬已成為廣西養(yǎng)豬的主要模式，但大量的種豬引進(jìn)、頻繁的生豬流通交易、部分規(guī)模化豬場(chǎng)不注意對(duì)疫病防控，導(dǎo)致圓環(huán)病毒2 型（PCV-2）成為危害廣西規(guī)?；B(yǎng)豬的主要疫病，感染PCV2 不僅造成豬群免疫抑制，更容易導(dǎo)致混合感染，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無(wú)囊膜，二十面體對(duì)稱的單股負(fù)鏈DNA，是迄今已知的最小動(dòng)物病毒[3]。基因大小約為2000bp，包含兩個(gè)主要的開放閱讀框[4]。目前，在病毒分類上將無(wú)致病性的PCV 命名為PCV1，而與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征相關(guān)的PCV 命名為PCV2[5]。2015年美國(guó)學(xué)者從豬群中檢測(cè)到一種能引起母豬皮炎腎病綜合征與繁殖障礙的PCV3[6-7]。臨床癥狀以新生仔豬先天性震顫、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、保育豬皮炎腎衰竭綜合征、母豬以繁殖障礙綜合征為主要癥狀。

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌感染引起的一種人畜共患病，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康。豬鏈球菌為一種有莢膜的革蘭氏陽(yáng)性球菌，具有一般鏈球菌屬的特性，呈球形或卵圓形，單個(gè)、成對(duì)存在或呈短鏈形態(tài)存在，溶血性兼性厭氧菌。豬鏈球菌的菌體長(zhǎng)短不一，大多數(shù)不能形成芽孢，無(wú)鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)[8]。本病也是豬場(chǎng)的常發(fā)傳染病之一，傳播的主要方式是通過(guò)呼吸道感染。該病發(fā)病范圍極廣，我國(guó)各地區(qū)均有此病的感染報(bào)道，本病一年四季均可發(fā)生，但秋季和初冬發(fā)病率較高，大小豬均易感染，發(fā)病率和死亡率較高[9]。本病的臨床癥狀主要為急性敗血型、腦膜腦炎型、亞急性和慢性型。

1 材料

1.1 主要試劑

病毒 DNA/RNA 提取試劑盒 、Taq MasterMix、DL 1500 DNA Marker 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠購(gòu)自西班牙GENE 公司。血平板培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 樣品來(lái)源

樣品來(lái)源于2019年廣西地區(qū)某規(guī)?；l(fā)病豬的脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等病料樣品。PCV2 陽(yáng)性疫苗保存于廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 臨床癥狀及剖檢變化

病豬精神不振，體溫升高，呼吸急促，后肢關(guān)節(jié)腫大，腹部、背部和臀部有紅色隆起。對(duì)病死豬剖檢可見，腹股溝淋巴結(jié)水腫，切面外翻多汁；腎臟腫大呈灰白色，肺間質(zhì)增寬出血，心包積液內(nèi)有豆腐渣樣白色液體，脾臟有梗死灶，胃底黏膜出血，腸系膜出血，腦部有少量積液；關(guān)節(jié)腫大，切面有清亮液體流出。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查

用無(wú)菌接種環(huán)取淋巴結(jié)、脾臟和肺臟樣品，采用平板劃線法，接種在血瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)18～24h 后觀察，并進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用NCCLS [10]推薦的K-B 紙片法，選用青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等10 類共24 種常用抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。

2.4 PCR 方法檢測(cè)

2.4.1 組織樣品RNA/DNA 提取

將病死豬脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等病料樣品放入研磨器中混合研磨，加入1.5ml 滅菌生理鹽水，收集于2.0ml 的EP 管中，-70℃反復(fù)凍融3 次，8000r/min 離心5min，取上清液置于另一滅菌的 1.5ml 離心管中，12000r/min 離心 15min，取上清液，按病毒DNA/RNA 提取試劑盒說(shuō)明提取組織樣品的RNA/DNA。提取的病毒核酸-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 中報(bào)道的 PCV2 病毒株（PCV2 登錄號(hào)DQ201639.1）全基因序列，進(jìn)行 PCV2 檢測(cè)。PCV2 檢測(cè)引物為 PCV2-F（5'- CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3'）和 PCV2-R（5'- ACCCCCGCC ACCGCTACC-3'），擴(kuò)增長(zhǎng)度 1154bp。引物由廣州華大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR 檢測(cè)方法

PCV2 的反應(yīng)體系為：2×Es Taq MasterMix 13μL，上游引物、下游引物各 1μL，DNA 模板 3μL，ddH2O 7μL，總反應(yīng)體系 25μL。瞬時(shí)離心混勻，反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min 30s ，35 個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸 10min。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離鑒定

無(wú)菌采取送檢病料的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟樣品于血瓊脂培養(yǎng)基平板上，在淋巴結(jié)和脾臟均分離到細(xì)菌。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可看到革蘭氏陽(yáng)性球菌，多呈鏈狀排列。進(jìn)行生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此病原菌可以將葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等發(fā)酵且不產(chǎn)氣，但不能發(fā)酵棉籽糖和木糖，也不產(chǎn)生H2S 氣體。經(jīng)過(guò)以上鑒定可以確定為豬鏈球菌感染。

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到的鏈球菌對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢噻肟、阿莫西林、氨芐西林等高度敏感，對(duì)利福平、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、磺胺六甲鈉等中度敏感，對(duì)氨曲南、克林霉素、林可霉素、呋喃唑酮、復(fù)方新諾明等不敏感。

3.3 PCV2 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用RT-PCR/PCR 的方法對(duì)病料樣品和陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)。陽(yáng)性樣品的片段大小在1154bp，鑒定表明該病料中PCV2 為陽(yáng)性（見附圖）。

4 預(yù)防治療

及時(shí)隔離治療發(fā)病豬，對(duì)病死豬和無(wú)治療價(jià)值的豬采取無(wú)害化處理，防止病原擴(kuò)散，對(duì)被污染的圈舍、場(chǎng)地和飼具進(jìn)行嚴(yán)格徹底消毒。對(duì)病豬采用肌肉注射頭孢噻呋、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)移因子，連用3～5d，對(duì)出現(xiàn)腦炎和關(guān)節(jié)炎的病豬同時(shí)肌注磺胺嘧啶鈉，首次加倍，連用3～5d。未發(fā)病豬緊急接種豬圓環(huán)病毒2 型滅活苗和鏈球菌多價(jià)滅活苗。全豬群飼料中添加黃芪多糖、泰樂(lè)菌素，飲水中添加多維。

5 小結(jié)與討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、臨床癥狀、剖檢分析，結(jié)果確診為該病豬是由于豬圓環(huán)病毒和鏈球菌混合感染。圓環(huán)病毒2 型侵襲豬的單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，是主要的免疫抑制性病原，導(dǎo)致豬群的免疫力下降，造成免疫失敗，誘發(fā)其他疫病的發(fā)生。目前我國(guó)PCV2 的感染率居高不下，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒目前尚無(wú)特效藥，疫苗接種是預(yù)防此病的有效手段，我國(guó)預(yù)防PCV2 的商品化疫苗主要是全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗。豬鏈球菌一年四季均可發(fā)生，控制其傳染的主要方法是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高豬群健康水平，加強(qiáng)豬場(chǎng)環(huán)境衛(wèi)生，接種有效的疫苗。對(duì)于豬疾病的防治要根據(jù)不同的豬、不同的病、不同的發(fā)病情況進(jìn)行具體分析，對(duì)癥下藥才能有效控制豬疾病，同時(shí)做好豬群健康保健工作是極其必要的。

附圖 PCV2 的PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果