脂多糖的作用機(jī)制與其在畜牧業(yè)的應(yīng)用

劉 波 唐小懿 周麗媛 謝 亮 方熱軍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.華農(nóng)恒青科技股份有限公司，江西 南昌 330013）

1 脂多糖結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

1.1 脂多糖及其結(jié)構(gòu)

脂多糖 （Lipopolysaccharides，LPS） 又稱內(nèi)毒素，是大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的主要成分，也存在于梳狀菌數(shù)等少數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，易被胃腸道吸收入循環(huán)系統(tǒng)。LPS的分子質(zhì)量為2～20ku，能夠提高細(xì)菌質(zhì)膜負(fù)電性，增加質(zhì)膜穩(wěn)定性，保護(hù)質(zhì)膜免受外界攻擊。LPS主要由O-抗原、核心寡糖和脂質(zhì)A組成，與磷脂類似有一親水頭和疏水頭。核心寡糖在中間連接位于外層具有親水結(jié)構(gòu)的O-抗原和位于內(nèi)層具有疏水性的類脂A。其中核心寡糖是由9～10個(gè)糖基組成的分枝寡糖鏈，又可被進(jìn)一步劃分為內(nèi)核心寡糖與外核心寡糖。內(nèi)核心寡糖通過酸不穩(wěn)定的酮苷鍵將核心寡糖附著于脂質(zhì)A。外核心寡糖主要由中性和堿性己糖組成，與O-抗原連接，其在不同菌株中存在單糖組成和構(gòu)型上的差異，是決定LPS核心型的基礎(chǔ)。脂質(zhì)A是LPS生物活性中心和主要的毒性成分，是先天性免疫應(yīng)答的有效刺激物，它由2個(gè)葡萄胺、磷酸鹽和一定量的脂肪酸構(gòu)成，高度保守，同一菌種的類脂A結(jié)構(gòu)基本保持一致。O-抗原多決定LPS的抗原性，保護(hù)細(xì)菌免受抗生素的危害和抵抗補(bǔ)體系統(tǒng)的溶解作用，是由一定長(zhǎng)度的寡糖單位首尾相連而行成的不同聚合度的聚合物，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。根據(jù)脂多糖中是否含有O-抗原，可將脂多糖分為含有一定數(shù)量O-抗原的光滑型脂多糖 （Smooth-LPS，S-LPS）和缺乏O-抗原僅由類脂A與核心寡糖組成的粗糙型脂多糖 （Rough-LPS，RLPS）。

1.2 脂多糖的提取

脂多糖的提取方法目前至少有18種。如煮沸法、超聲波法、苯酚-氯仿-石油、100°C水提取、脂、多糖試劑盒提取方法、熱酚水法、丁醇提取、醚提取法、Hitchcock-Brown法等。目前最常用的方法是熱酚水法和醚提取法。熱酚水提取法適用S-LPS的提取，利用LPS可以溶于水相，蛋白質(zhì)由于酚的作用變性沉淀而被去除，同樣溶于水相的核酸則通過核酸酶的消化來去除，從而得到純度較高的LPS。該方法的優(yōu)點(diǎn)是提取LPS產(chǎn)量大且純度高，但操作復(fù)雜，需要的細(xì)菌量大，危險(xiǎn)性較高。醚提取法更適合R-LPS，因?yàn)镽-LPS不含親水的O-抗原，利用熱酚水提取法容易被萃取到酚相中，但其不溶于醚，從而可以實(shí)現(xiàn)R-LPS的提取。

1.3 脂多糖生物學(xué)作用

LPS在細(xì)菌正常生活狀態(tài)時(shí)不釋放，但在細(xì)菌菌體死亡破裂、人工方法裂解后釋放或細(xì)胞活躍生長(zhǎng)繁殖時(shí)釋放出來，其本身無毒性作用，但其作為非特異性免疫原，當(dāng)進(jìn)入微循環(huán)后與宿主效應(yīng)細(xì)胞 （主要為單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）相互作用分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、 活性氧自由基 （ROS）、NO等生物活性分子，引起機(jī)體發(fā)熱、彌散性血管內(nèi)凝血、多器官機(jī)能衰竭及休克等臨床綜合癥。LPS的毒性是通過LPS在細(xì)菌周圍形成一層保護(hù)屏障以逃避抗生素的作用，作用于宿主細(xì)胞，產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于紊亂狀態(tài)，引起內(nèi)毒素血癥、膿毒癥等疾病。LPS的活性主要因其具有免疫激活作用，可以抗腫瘤、抗輻射、抗感染、促進(jìn)后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生、促進(jìn)牙周炎癥、促進(jìn)包細(xì)胞增生和緩解哮喘等多種生物學(xué)功能。

2 LPS作用機(jī)制

2.1 與LPS作用的相關(guān)受體

2.1.1 Toll樣受體 （Toll-Like Receptors,TLRs）

Toll樣受體屬于模式識(shí)別受體 （Patternrecognition Receptors,PRRs）家族，至今已發(fā)現(xiàn)10多種TLRs，其中TLR4是研究最多也是最主要的受體。研究表明，TLR4的識(shí)別范圍較窄，僅識(shí)別革蘭陰性菌和胞壁成份多糖 （LPS）。TLR4在LPS刺激后起著重要作用，誘導(dǎo)宿主防御機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活和共刺激分子與細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

2.1.2 脂多糖結(jié)合蛋白 （Lipopolysaccharide Binding Protrin,LBP）

脂多糖結(jié)合蛋白是一種Ⅰ型急性期反應(yīng)蛋白，主要存在于人和動(dòng)物血清中，對(duì)類脂A有高度的親和性，有磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)作用。LPS一般以多聚體的形式存在，但LPS的有效激活形式是LPS單體，LBP可以加劇LPS解離成單體。當(dāng)前認(rèn)為L(zhǎng)BP的生物學(xué)功能具有濃度依賴性的雙重效應(yīng)，低濃度時(shí)有促炎作用，高濃度則表現(xiàn)為抑制炎癥的效應(yīng)。

2.1.3 CD14分子

CD14分子式LPS的關(guān)鍵受體之一，它的N段富含亮氨酸重復(fù)單位，有識(shí)別LPS的作用，且對(duì)LPS具有高親和性。CD14分子有兩種存在方式：：表達(dá)于髓源性細(xì)胞表面的膜CD14(mCD14)和血清中的可溶性 CD14（sCD14）。mCD14分子主要介導(dǎo)髓源性細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。mCD14分子對(duì)LPS有高親和力，可以使極低水平的LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的反應(yīng)；sCD14分子主要介導(dǎo)那些不表達(dá)mCD14的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，對(duì)機(jī)體有雙重功效。CD14的主要生物學(xué)功能是識(shí)別、結(jié)合LPS或LPS-LBP復(fù)合物，進(jìn)而激活效應(yīng)細(xì)胞。

2.1.4 髓樣分化蛋白-2（Myeloid Differentiation protein-2,MD-2）

髓樣分化蛋白-2是一種可溶性的分泌蛋白，主要存在于單核巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面。在LPS介導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)中主要與TLR4的胞外區(qū)結(jié)合，形成TLR4-MD-2復(fù)合體幫助TLR4與LPSLBP-CD14三聯(lián)體的結(jié)合。

2.2 LPS誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)通路

LPS參與細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)時(shí)有2條不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。第1條是髓樣分化因子88（Myeloid Differentiation factor 88,MyD88） 承接的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑稱為MyD88依賴途徑依，第2條是由β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白 （TRIF）聯(lián)接的信號(hào)通路被稱為MyD88非依賴途徑，兩者都由LPS和TLR4的關(guān)聯(lián)觸發(fā)。

LPS進(jìn)入血液循環(huán)，LBP可以識(shí)別LPS，加快LPS解離成單體，使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露出來，并與其結(jié)合運(yùn)送至髓源性細(xì)胞表面。髓源性細(xì)胞表面的CD14與之結(jié)合形成LPS-LBP-CD14三聯(lián)復(fù)合體，隨后LBP作為載體蛋白將其轉(zhuǎn)運(yùn)至TLR4-MD-2蛋白復(fù)合體處，MD-2識(shí)別并與LPS結(jié)合形成TLR4-MD-2-LPS三聚體，激活TLR4跨膜信號(hào)通路。 （1）MyD88依賴途徑：TLR4被激活后，發(fā)生構(gòu)象的改變和二聚化，將信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，TLR4與MyD88的羧基端結(jié)合，MyD88通過其死亡域與IL-1受體相關(guān)激酶1（IL-1 Receptor-associated Kinase 1,IRAK1）的死亡域相結(jié)合，使IRAK1磷酸化。磷酸化后的IRAK1與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF–α Receptor-associated Factor 6,TRAF6）結(jié)合并使其激活。TRAF6使IRAK1連接于NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK），NIK被激活后進(jìn)一步激活NF-κB抑制蛋白 （IκB） 酶復(fù)合物 （IKKα， IKKβ）， 活化的IKK復(fù)合體作用于IκB，使IκB2個(gè)絲氨酸位點(diǎn)被磷酸化而降解。IκB降解后與NF-κB分離，導(dǎo)致NF-κB活化并遷移到到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)如TNF-α、IL-1、IL-6、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 （iNOS）等，發(fā)揮致炎效應(yīng) [41-46]。 （2）MyD88非依賴途徑：TLR4被激活后其胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域與Toll樣受體相關(guān)分子 （TRIF-related Adaptor Molecule,TRAM）相連，作用于TRIF使其活化并與TRAF6結(jié)合，然后將信號(hào)傳導(dǎo)至干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF-3），將其磷酸化后形成同源二聚體，轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)干擾素 （Interferon,IFN）基因表達(dá)，引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)。

3 LPS在畜牧業(yè)的應(yīng)用

LPS是目前所知十分有效的應(yīng)激源，常在畜牧業(yè)中用來建立應(yīng)激模型，模擬動(dòng)物在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)激。LPS不僅可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫及氧化應(yīng)激。雖然LPS刺激與實(shí)際飼養(yǎng)過程中活細(xì)菌誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)不一樣，其建立的模型也不能完全模擬畜禽場(chǎng)中實(shí)際的應(yīng)激反應(yīng)，但是由于LPS模擬動(dòng)物應(yīng)激重復(fù)性好，因而被廣泛用于應(yīng)激機(jī)理及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)研究。

3.1 免疫應(yīng)激及模型建立

免疫應(yīng)激是指畜禽機(jī)體受到外界微生物的攻擊，免疫系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)以抵抗微生物入侵。畜禽遭受免疫應(yīng)激會(huì)出現(xiàn)嘔吐、氣喘、發(fā)熱、厭食、臥地不起等異常反應(yīng)；IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞增多，生產(chǎn)性能、免疫功能下降，甚至造成動(dòng)物死亡，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一般來說，炎癥反應(yīng)是免疫應(yīng)激的標(biāo)志。免疫應(yīng)激包含著復(fù)雜的生理反應(yīng)，涉及 “神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫”等系統(tǒng)。神經(jīng)系統(tǒng)通過其豐富的外周神經(jīng)突觸及其分泌的神經(jīng)遞質(zhì)和一些內(nèi)分泌激素，還有神經(jīng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能。免疫系統(tǒng)是通過細(xì)胞因子和激素樣物質(zhì)反饋?zhàn)饔糜谏窠?jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。下丘腦—垂體—腎上腺軸 （HPA）是神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中主要的應(yīng)激軸。糖皮質(zhì)激素是HPA軸的最終產(chǎn)物，一般認(rèn)為免疫應(yīng)激對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)作用機(jī)制是由糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的。腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的主要有皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇等，對(duì)免疫系統(tǒng)具有廣泛的作用。大量研究表明在畜禽機(jī)體注射LPS，可引起畜禽體溫升高，氣喘等表現(xiàn)，生產(chǎn)性能下降，前列腺素E2和皮質(zhì)醇濃度增加、炎性因子白細(xì)胞介素1β （IL-1β）、 IL-2、 TNF-α 等含量增加， 成功建立免疫應(yīng)激模型。

3.2 氧化應(yīng)激及模型建立

畜禽機(jī)體內(nèi)存在氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)，正常生理情況下它們處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體受到各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)ROS等高活性分子過量產(chǎn)生，超出機(jī)體自身抗氧化防御體系清除的能力，氧化與抗氧化狀態(tài)失衡，自由基在機(jī)體內(nèi)積累，導(dǎo)致機(jī)體處于過氧化損傷的狀態(tài)，就叫做氧化應(yīng)激。在正常情況下，機(jī)體代謝微量的ROS對(duì)細(xì)胞維持正常功能是有一定積極作用的，當(dāng)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化保護(hù)系統(tǒng)不能很好的維持活性氧的產(chǎn)生和清除時(shí)，過多的ROS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞損傷、凋亡和壞死，引發(fā)各種疾病，導(dǎo)致幼畜成活率低、畜產(chǎn)品品質(zhì)下降等。機(jī)體中的抗氧化防御系統(tǒng)分為兩類物質(zhì)：酶類抗氧化物質(zhì)和非酶類抗氧化物質(zhì)。酶類抗氧化物質(zhì)通常包括：超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSHPx）、過氧化氫酶 （CAT）、硫氧化還原蛋白（TRX）等。非酶類抗氧化物主要包括：維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素、尿酸和谷胱甘肽（GSH）等。細(xì)胞中ROS有內(nèi)源性和外源性兩種存在形式。內(nèi)源性主要來自線粒體呼吸鏈和和胞質(zhì)中NADPH氧化酶；而外源性ROS可由化學(xué)毒物和炎性細(xì)胞因子等產(chǎn)生。大量研究表明動(dòng)物機(jī)體內(nèi)注射LPS可引起脂質(zhì)過氧化損傷物 （丙二醛）含量升高、血清和組織中抗氧化指標(biāo)（SOD、GSH-Px、CAT）含量降低，產(chǎn)生ROS和O2-等，引起氧化應(yīng)激。強(qiáng)烈而持久的氧化應(yīng)激可能是因LPS刺激產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)，交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)分泌大量的兒茶酚胺，兒茶酚胺氧化能產(chǎn)生有毒性的氧自由基，導(dǎo)致自由基在體內(nèi)蓄積而引起細(xì)胞毒性，引發(fā)過氧化損傷。

3.3 抗應(yīng)激營(yíng)養(yǎng)添加劑

牛膝多糖是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有增強(qiáng)免疫，恢復(fù)免疫系統(tǒng)損傷的功能。朱惠玲等（2011）研究表明在對(duì)LPS刺激的仔豬日糧中添加500mg/kg牛膝多糖可以降低LPS刺激的豬炎性因子、前列腺素E2（PGE2）和皮質(zhì)醇的含量，緩解了仔豬免疫應(yīng)激神經(jīng)內(nèi)分泌的改變。魚油富含n-3多不飽和脂肪酸 （n-3PUFA）可以調(diào)控炎癥、免疫功能和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。Yang等（2008）研究發(fā)現(xiàn)魚油可以提高LPS刺激下雞的飼料轉(zhuǎn)化率，降低NF-kB的mRNA的豐度，減少TNF-α、IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生，提高血清IgG含量，從而緩解免疫應(yīng)激。研究表明N-乙酰半胱氨酸 （NAC）可以提高抗氧化能力，緩解LPS應(yīng)激導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制，降低TNF-α，皮質(zhì)醇、IL-6和前列腺素E2的濃度，緩解NF-kB和熱休克蛋白70（HSP70）蛋白水平的顯著升高，并且提高血漿表皮生長(zhǎng)因子 （EGF）水平和腸表皮生長(zhǎng)因子受體 （EGFR）mRNA。EGF作為一種促生長(zhǎng)的活性多肽可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)腸道發(fā)育，提高腸細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力。據(jù)此推測(cè)NAC可能通過促進(jìn)EGF分泌，從而緩解LPS刺激造成的生長(zhǎng)抑制及炎癥反應(yīng)等。通過NF-kB信號(hào)通路影響炎性因子的表達(dá)，緩解免疫應(yīng)激。谷氨酰胺 （GLN）是人體及其他哺乳動(dòng)物中含量最豐富的一種游離氨基酸，可以維持和提高組織細(xì)胞內(nèi)GSH含量，清除各種自由基和過氧化物對(duì)細(xì)胞的損害。李歡等 （2017）通過給斷奶仔豬腹腔注射LPS建立氧化應(yīng)激模型，在飼料中添加1%GLN與應(yīng)激組相比，降低了血清MDA、SOD、GSH-Px和CAT活性，提高了血清T-AOC的含量，腸粘膜谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX1）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、鋅銅超氧化物歧化酶 （CuZnSOD）和錳超氧化物歧化酶 （MnSOD）基因相對(duì)表達(dá)量增多，從而緩解LPS引起的應(yīng)激反應(yīng)，提高仔豬的抗氧化能力。

4 小結(jié)

LPS作為大多數(shù)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，其結(jié)構(gòu)組成與細(xì)菌致病能力息息相關(guān)。大量的研究已經(jīng)在LPS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、生物學(xué)作用和作用機(jī)制等方面取得了許多成果，但LPS激活的過程具有多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，涉及多個(gè)雙重作用的受體，是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。目前LPS是建立應(yīng)激模型最經(jīng)典的方式，其對(duì)研究應(yīng)激機(jī)理及應(yīng)激條件下畜禽免疫功能、抗氧化功能、生產(chǎn)性能、物質(zhì)代謝產(chǎn)生的影響，對(duì)于研發(fā)抗應(yīng)激劑、減少應(yīng)激的發(fā)生具有十分重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。但LPS建立的模型通常是急性應(yīng)激模型，在實(shí)際生產(chǎn)中，畜禽的環(huán)境變化是相對(duì)較慢的，這種應(yīng)激對(duì)畜禽所造成的也是屬于慢性的。而肌肉或者腹腔注射LPS引起的應(yīng)激持續(xù)時(shí)間較短，大約為24h，而且應(yīng)激效應(yīng)還與注射的劑量存在明顯關(guān)系，如果多次注射LPS還可能會(huì)產(chǎn)生耐受性。雖然本文未對(duì)LPS建立應(yīng)激模型的劑量進(jìn)行總結(jié)比較，但不同物種對(duì)LPS的耐受能力是有很大的差別。因此在建立LPS應(yīng)激模型時(shí)，應(yīng)充分考慮動(dòng)物對(duì)LPS的耐受能力，從而建立起注射劑量相當(dāng)（既能引起免疫應(yīng)激又不致死）和應(yīng)激時(shí)間充分的應(yīng)激模型。