重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)及其在豬病毒性腹瀉病原基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用

于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

豬病毒性腹瀉是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重的一類疾病，導(dǎo)致仔豬大量死亡，損失慘重，常見豬病毒性腹瀉病原有豬流行性腹瀉（PEDV）、豬傳染性胃腸炎（TGEV）、輪狀病毒（RV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）、豬嵴病毒（PKV）、豬博卡病毒（PBoV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒 2型（PCV2）等[1-3]。僅靠臨床表現(xiàn)和病變很難將病毒性腹瀉與營養(yǎng)性腹瀉、細(xì)菌性腹瀉等進(jìn)行鑒別，需進(jìn)行檢測(cè)確診，當(dāng)前常用的檢測(cè)方法主要有病毒分離、PCR檢測(cè)、熒光PCR檢測(cè)、間接免疫熒光等，這些方法耗時(shí)長，操作繁瑣，需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。雖然膠體金檢測(cè)卡適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但檢測(cè)敏感性低、容易漏檢，且市場(chǎng)上產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。疾病的正確診斷是進(jìn)行精準(zhǔn)防控的前提和基礎(chǔ)，誤診易導(dǎo)致誤治，貽誤病情造成損失。因此急需開發(fā)病原現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)新技術(shù)，以及早確診疾病，采取措施，降低養(yǎng)殖場(chǎng)損失。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）是2006年由英國科學(xué)家研發(fā)的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[4]。它不需要高溫變性，不需要昂貴的儀器，而是利用多種酶參與，在體外模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，恒溫條件下短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)靶基因大量擴(kuò)增，既可以擴(kuò)增DNA，也可以擴(kuò)增RNA[5]。其基礎(chǔ)反應(yīng)體系與其他技術(shù)結(jié)合，衍生出多種核酸檢測(cè)新技術(shù)，可以真正實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)核酸快速檢測(cè)。2014年，英國TwistDX公司推出了商業(yè)化的RPA檢測(cè)試劑盒，有力地推動(dòng)了該技術(shù)在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)學(xué)以及生物學(xué)檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用[6]。RPA技術(shù)具有恒溫、快速、便攜、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[7]，是目前唯一有望替代PCR技術(shù)的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，在基層現(xiàn)場(chǎng)診斷中，具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。本文綜述了RPA技術(shù)的原理、產(chǎn)物檢測(cè)方式及在豬病毒性腹瀉病原檢測(cè)中應(yīng)用，旨在為豬病毒性腹瀉病原的基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供參考。

1RPA技術(shù)介紹

1.1 RPA技術(shù)原理

RPA等溫?cái)U(kuò)增原理與T4噬菌體的DNA復(fù)制機(jī)制類似，主要利用噬菌體重組酶UvsX及其輔助因子UvsY、寡核普酸引物、單鏈核酸結(jié)合蛋白（SSB），鏈置換DNA聚合酶，模板和MgCl2在恒溫下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)增長，不需要高溫?zé)嶙冃訹9]。重組酶與寡核普酸引物結(jié)合，形成重組酶引物復(fù)合物，重組酶引物復(fù)合物掃描雙鏈DNA，識(shí)別其中一條與引物序列互補(bǔ)的模板DNA并形成D環(huán)結(jié)構(gòu)，SSB則與另一條單鏈DNA結(jié)合使之穩(wěn)定。隨后，在ATP作用下重組酶與引物解離，D環(huán)消失，引物3′端暴露，在DNA聚合酶作用下，3′端開始延伸擴(kuò)增，2條引物同時(shí)啟動(dòng)和完成合成過程，不斷重復(fù)整個(gè)過程，目標(biāo)產(chǎn)物迅速呈指數(shù)增長，一般20 min內(nèi)即能完成擴(kuò)增反應(yīng)。

1.2 產(chǎn)物檢測(cè)及衍生技術(shù)

RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法有多種，目前常用的有3種，即凝膠電泳法、實(shí)時(shí)熒光RPA（RT-RPA）檢測(cè)法及橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)法等[10]。凝膠電泳法所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低，但電泳前需要純化擴(kuò)增產(chǎn)物，否則會(huì)有拖尾現(xiàn)象。產(chǎn)物純化和凝膠電泳增加了檢測(cè)時(shí)間。

RT-RPA檢測(cè)時(shí)需要額外設(shè)計(jì)1條exo探針，探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)熒光強(qiáng)度低，探針與靶序列結(jié)合時(shí)，連接熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的堿基類似物被核酸外切酶降解，淬滅基團(tuán)被釋放，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。3′端進(jìn)行封閉修飾，以阻止探針充當(dāng)引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)[11]。與熒光PCR方法類似，需要配備熒光檢測(cè)設(shè)備，通過熒光信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物定量檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，但終產(chǎn)物不能再用電泳方式檢測(cè)，因擴(kuò)增產(chǎn)物在反應(yīng)結(jié)束時(shí)會(huì)被降解。5～15 min即可完成檢測(cè)反應(yīng)，產(chǎn)物不需要開蓋檢測(cè)。

橫向流行試紙條檢測(cè)，需要額外設(shè)計(jì)1條nfo探針，并在其下游引物在5′端標(biāo)記生物素（Biotin），探針上游標(biāo)記異硫氰酸熒光素（FITC）或6-羧基熒光素（FAM），中間位置采用THF替代一個(gè)堿基，3′端進(jìn)行磷酸化處理。探針長度過短會(huì)降低重組率，過長會(huì)有非特異性擴(kuò)增，通常探針濃度為120 nmol/L。擴(kuò)增反應(yīng)不需要復(fù)雜設(shè)備，產(chǎn)物檢測(cè)前需要20倍稀釋，室溫下5 min內(nèi)可完成檢測(cè)反應(yīng)，但如果不稀釋擴(kuò)增產(chǎn)物容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，結(jié)果讀取時(shí)間超過5 min也容易出現(xiàn)假陽性，擴(kuò)增產(chǎn)物也可以直接電泳檢測(cè)。與膠體金檢測(cè)抗原類似，在檢測(cè)線上形成“生物素抗體-核酸-納米金?！睆?fù)合物顯色。質(zhì)控線上包被抗FITC或FAM抗體的固定抗體，可直接與帶FAM抗體的納米金顆粒結(jié)合，在質(zhì)控線上顯色，以確保試紙條的有效性。裸眼可觀察結(jié)果，對(duì)檢測(cè)人員要求低，可用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2 RPA技術(shù)在豬病毒性腹瀉病原檢測(cè)中的應(yīng)用

呂繼洲等[12]基于PED病毒M基因保守序列，設(shè)計(jì)一系列擴(kuò)增引物及其熒光探針，建立了一種PEDV實(shí)時(shí)熒光RPA等溫檢測(cè)方法。結(jié)果表明，該實(shí)時(shí)熒光RPA方法可在39℃恒溫反應(yīng)20 min特異性擴(kuò)增PED病毒M基因，與TGEV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、PCV2及CSFV等對(duì)照病毒基因無交叉反應(yīng)，其檢測(cè)限為10拷貝/μL。劉占旭等[13]根據(jù)GenBank中公布的PKV基因組序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，建立了PKV的RPA快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該方法在38℃恒溫反應(yīng)30 min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)PKV目的基因片段的有效擴(kuò)增，以PEDV、TGEV、PDCoV、口蹄疫病毒（FMDV）、PRRSV 為模板時(shí)均未檢測(cè)到特異性擴(kuò)增條帶，表明該方法具有良好的特異性，用 3.36×107、3.36×106和 3.36×105copies/L 3個(gè)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，均能擴(kuò)增出特異性條帶，表明該方法具有良好的重復(fù)性。該方法檢測(cè)的最低限度為3.36×102copies/L的質(zhì)粒DNA，具有良好的敏感性。肖帥等[14]針對(duì)PDCoV N基因設(shè)計(jì)特異的引物，建立了PDCoV RPA檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)中以PRRSV、PEDV、PKV、TGEV和FMDV為模板時(shí)均未產(chǎn)生任何條帶，特異性較好。該檢測(cè)方法的靈敏度為103copies/μL，敏感性較好。王金鳳等[15]基于CSFV 5′UTR保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了可快速檢測(cè)CSFV的反轉(zhuǎn)錄RPA檢測(cè)方法。該方法在40℃下恒溫20 min即可完成反應(yīng)，且特異性強(qiáng)，與其他瘟病毒和豬的重要病原無任何交叉反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄的CSFV RNA為模板，該方法的檢出下限為102copies。黃超華等[16]以PCV2 Cap基因的保守序列為靶序列，設(shè)計(jì)并篩選出一組特異性的引物和探針，建立了快速檢測(cè)PCV2核酸的RPA方法。結(jié)果顯示，該方法特異性強(qiáng)，對(duì)豬圓環(huán)病毒 1型（PCV1）、PRV、豬細(xì)小病病毒（PPV）、PRRSV、CSFV核酸檢測(cè)結(jié)果均為陰性，靈敏性高，最低可檢出核酸濃度為0.87×10-4ng/μL，簡(jiǎn)單快速，且重復(fù)性好。劉立兵等[17]基于PRV gB和gE基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了PRV野毒和疫苗毒雙重RPA檢測(cè)方法，該方法在38℃水浴鍋中恒溫反應(yīng)20 min，能夠在同一個(gè)反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)對(duì)PRV野毒和疫苗毒的特異性鑒別檢測(cè)，而與其他常見的豬病毒沒有交叉反應(yīng)。所建立的雙重RPA方法對(duì)PRV gB和gE基因的檢測(cè)限均為102拷貝，并且與熒光定量PCR方法檢測(cè)限一致。

3 小結(jié)與展望

RPA技術(shù)自開發(fā)以來，深受廣大檢測(cè)工作者歡迎，在生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，并衍生出許多新技術(shù)，成為恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的主流，也是最有希望取代PCR的核酸擴(kuò)增技術(shù)。RPA不受場(chǎng)地的限制，不需要昂貴儀器，對(duì)溫度要求低，恒溫?cái)U(kuò)增，時(shí)間短，可以在資源匱乏地區(qū)實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的目的，目前已廣泛用于食品安全及動(dòng)物疫病檢測(cè)。RPA作為一種新興起的檢測(cè)技術(shù)，也存在著一些缺點(diǎn)和不足。RPA主要利用多種酶實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)，任何一種酶失活都可致擴(kuò)增失敗，因擴(kuò)增體系存在大量蛋白酶，需去除蛋白后才能電泳或后續(xù)試驗(yàn)。RPA所用試劑均來自英國TwistDx公司，單份檢測(cè)費(fèi)用高。引物要求高，無專門設(shè)計(jì)軟件，僅有篩選原則，需通過手動(dòng)方式進(jìn)行大量引物篩選，優(yōu)化反應(yīng)體系，增加研發(fā)時(shí)間和費(fèi)用。未來RPA技術(shù)可能在以下方面進(jìn)一步突破：1）研發(fā)專門引物設(shè)計(jì)軟件，降低引物設(shè)計(jì)難度；2）反應(yīng)溫度范圍拓寬，不局限于某一溫度，可在某溫度范圍內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)；3）實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，降低成本，提高效率，與基因芯片等其他技術(shù)聯(lián)合，使結(jié)果判定更簡(jiǎn)便直觀；4）研發(fā)出價(jià)格低廉、高效的酶制劑，降低成本。相信隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，勢(shì)必會(huì)引起一場(chǎng)核酸檢測(cè)的革命，取代PCR技術(shù)在分子檢測(cè)中的霸主地位，在豬腹瀉性病毒病原的基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用。